三种HPV-DNA检测法在筛查高危型HPV感染中的应用效果

陆妹英

（柳州市工人医院，广西 柳州 545005）

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。相关的调查数据显示，宫颈癌的发病率排在全球女性恶性肿瘤发病率的第四位。宫颈癌患者在发病的初期无特异性症状，其病情易被误诊为其他疾病。多数此病患者的病情被确诊时往往已经进展至中晚期，进而延误了治疗的时机[1]。对宫颈癌患者的病情进行早期筛查及确诊对改善其预后具有重要的意义。大量的流行病学及分子生物学研究结果显示，持续存在的高危型人乳头状瘤病毒（HPV）感染是导致宫颈癌及宫颈癌癌前病变的主要病因[2]。HPV是一种无包膜病毒，由8000个碱基对组成的双链环状DNA及正二十面体蛋白质衣壳组成。HPV感染可分为黏膜表面感染和皮肤感染[3]。本次研究主要探讨三种HPV-DNA检测法在筛查高危型HPV感染中的应用效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究的对象为2019年1月至2020年10月期间在柳州市工人医院接受妇科检查的21 965例受检者。这21 965例受检者均知晓本次研究的内容，并签署了参加本次研究的知情同意书。本次研究对象的排除标准是：1）临床资料不全者。2）中途退出本次研究者。这21 965例受检者的年龄为19～99岁，平均年龄为（65.6±9.4）岁。按照检测方法的不同将这21 965例受检者分为DH3法组（n=12 648）、HPV原位杂交法组（n=5）和实时荧光定量PCR法组（n=9312）。本次研究获得了柳州市工人医院医学伦理委员会的批准。

1.2 研究方法

对DH3法组受检者使用DH3法进行HPV-DNA检测，方法是：1）采集受检者宫颈部位的脱落细胞作为检测标本。2）将检测标本滴入DH3 HPV核酸检测试剂盒的捕获微孔板中，严格按照试剂盒的质控要求进行操作。3）根据试剂盒底物的光强度判断HPV-DNA的数量。对HPV原位杂交法组受检者使用HPV原位杂交法进行HPV-DNA检测，方法是：1）用一次性宫颈软毛刷采集受检者宫颈部位的脱落细胞放入标本瓶中。2）用过滤器滤出细胞后移至载玻片上，采用三步法对细胞涂片进行染色。先在细胞涂片上加入地高辛抗体识别地高辛并标记靶点，再加入兔抗鼠抗体与地高辛抗体进行结合，然后加入辣根过氧化物酶检测试剂。将3.3-二氨基联苯胺（DAB）作为显色底物，对细胞涂片进行显色后，根据杂交信号的有无判断是否感染HPV。当细胞核呈黄色、棕黄色或棕褐色着色、但细胞质和细胞膜无着色时即可判定HPV阳性。对实时荧光定量PCR法组受检者使用实时荧光定量PCR法进行HPV-DNA检测，方法是：1）采集受检者宫颈部位的脱落细胞作为检测标本。2）使用实时荧光定量PCR仪及配套试剂盒对检测标本进行HPV-DNA检测。对三组受检者中HPV-DNA检测结果呈阳性者进行阴道镜活检，方法是：1）对受检者的阴道进行清洁、消毒后，使用活检钳咬取其可疑病变部位一定量的组织作为标本送至病理科。要求患者在采集标本前的3 d内无性交活动及阴道用药史，且处于非月经期。2）对组织标本进行切片、包埋、染色处理后，观察其细胞和组织的形态结构变化的情况。3）根据患者组织标本的细胞及组织形态结构，判定其是否发生HPV感染及HPV感染的程度[4]。

1.3 观察指标

观察三组受检者进行阴道镜活检结果与进行HPV-DNA检测结果的符合率。符合率﹦阴道镜活检高危型HPV感染的例数∕HPV-DNA检测阳性的例数×100%。

1.4 统计学处理

对本次研究中的数据均采用SPSS 18.0统计软件进行处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ²检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

进行阴道镜活检的结果为，DH3法组中高危型HPV感染者有546例患者，HPV原位杂交法组中高危型HPV感染者有5例，实时荧光定量PCR法组中高危型HPV感染者有332例。DH3法组受检者阴道镜活检结果与HPV-DNA检测结果的符合率为89.22%（546∕612），HPV原位杂交法组受检者阴道镜活检结果与HPV-DNA检测结果的符合率为100%（5∕5），实时荧光定量PCR法组受检者阴道镜活检结果与HPV-DNA检测结果的符合率为93.26%（332∕356）。详见表1。

表1 三组受检者检测结果的比较

3 讨论

相关的调查结果显示，有90%以上的宫颈癌患者是由高危型HPV感染所致[5]。宫颈癌患者在发病的初期会出现接触性出血、阴道排液异味等症状，当其病情发展至中晚期还会出现不规则阴道流血及感染等症状。目前，临床上检测HPV-DNA的方法有DH3法、HPV原位杂交法和实时荧光定量PCR法等。DH3 HPV核酸检测试剂盒是一种快速HPV-DNA检测试剂盒。该试剂盒中的变性试剂可使宫颈脱落细胞HPV的双链DNA变性分解成单链DNA，单链DNA可与特异性RNA探针结合为DNA-RNA杂合体，DNARNA杂合体与捕获微孔板上的特异性抗体相结合后，与偶联碱性磷酸酶的抗DNA-RNA杂合体中的特异性抗体相结合后会在酶促反应下发光，然后观察者可根据底物的光强度判断HPV-DNA的数量。DH3 HPV核酸检测试剂盒中的特异性RNA探针可与HPV的14种亚型相结合，形成14种DNA-RNA杂合体，能够有效地避免假阴性及假阳性检测结果的产生，适用于对宫颈疾病的初步筛查及定性监测。HPV原位杂交法主要是通过三步法对细胞涂片进行染色，再将DAB作为显色底物对细胞进行显色，然后根据杂交信号的有无判断是否感染HPV，当细胞核呈黄色、棕黄色或棕褐色着色、但细胞质和细胞膜无着色时即可判定HPV阳性。HPV原位杂交法可以准确定位HPV细胞，明确组织细胞中HPV的位置及感染的程度。但是，由于本次研究中HPV原位杂交法组纳入的样本量较少，故未能准确地反映出HPV原位杂交法检测HPV-DNA的效果。实时荧光定量PCR技术主要是利用DNA变性与复性原理，对宫颈脱落细胞进行特定的DNA片段高效扩增，特异性引物及探针分别与靶序列相结合，Taq酶在引物的引导下复制靶序列，遇到结合2条引物之间的探针时发挥“5”游离端外切酶的功能，使探针水解形成游离羧基荧光素发射荧光，合成HNA链发射的荧光信号量的增加与序列指数的增长呈正相关。但是，使用实时荧光定量PCR法检测HPV-DNA时，不仅需要使用专用的实验室，而且对检测人员的技术要求较高，不适于作为普查HPV感染的检测方法[6]。上述研究结果说明，与使用HPV原位杂交法和实时荧光定量PCR法相比，使用DH3法进行HPV-DNA检测具有操作简便、无需PCR实验室、对操作人员无特殊资质要求、价格低廉等特点，适合在各医疗机构中推广应用。

综上所述，使用DH3 HPV-DNA检测法、HPV原位杂交 HPV-DNA检测法和实时荧光定量PCR HPV-DNA检测法筛查高危型HPV感染均具有较高的应用效果。与应用HPV原位杂交 HPV-DNA检测法和实时荧光定量PCR HPV-DNA检测法相比，用DH3 HPV-DNA检测法筛查高危型HPV感染更为简单、方便、快捷，更适用于对HPV感染进行大范围的筛查。