砷胁迫下外源磷对香蒲根表铁膜形成及吸附砷的影响

俞佳 ，黄颖 ，张晋龙，刘云根 *，王妍，杨思林

1.西南林业大学生态与环境学院，云南 昆明 650224；2.云南省山地农村生态环境演变与污染治理重点实验室，云南 昆明 650224

砷（As）是环境中常见的有毒类金属，其主要产生于地质和人为活动。人类活动包括金属开采和冶炼，含 As农药、除草剂、木材防腐剂、食品添加剂等的使用，以及含 As染水灌溉。美国环境保护署（EPA）将As列为有效的人类致癌物，并且是造成严重健康问题的主要原因（纪冬丽等，2016）。磷（P）作为一种常见的营养元素，大量的排放进入水体会造成水体富营养化等一系列环境问题（赵祖军等，2018）。

云南地处高原地区拥有数量众多的高原湿地且各种矿产资源十分丰富尤其以磷矿和有色金属矿物为主，在矿产资源开发利用过程中As、P等元素也会随着水体而进入湿地（刘总堂等，2010；Xing et al.，2017）。湿地有着净化水质等重要生态功能（邱彭华等，2010），湿地植物由于其独特的生长生存环境产生了一系列适应淹水环境的生理生态特征，其中根表铁膜就是一种重要的生态现象。根表铁膜有着独特的结构特征，是一种两性胶体对环境中的各种元素都有一定的吸附能力，是植物抵御胁迫的一种重要手段（陈春丽等，2014；刘春英等，2014）。研究表明，广泛存在于湿地植物根表的铁膜（Zimmer et al.，2011；Huang et al.，2012），因其具有较大的表面积并带有正负电荷基团，可以通过吸附和共沉淀等作用，影响养分和重金属元素在土壤中的化学行为和生物有效性，对湿地植物根系吸收养分和拦截污染物起着重要的门户作用（Zhang et al.，2020）。目前，有关于根表铁膜对水稻吸收营养物质和污染物影响的研究已有较多报道，对于湿地植物铁膜的研究也有开展，但由于铁膜的生成是一个动态的过程，在植物的不同生长时期有一定的差异性。

香蒲被公认为是湿地水生植物中的优势物种对多种重金属具有较高的耐性，是吸收重金属的优良水生植物，但在湿地生态环境中，As污染下香蒲对 As的积累与迁移特征及影响机制的相关研究尚待进一步深入（任伟等，2019）。根表铁膜广泛生成与香蒲根系上与香蒲吸收砷有着密切关系。因此，亟待研究在受到As污染的湿地在外源P输入情况下典型湿地植物香蒲整个生长期内根表铁膜的生成及其对 As的吸附规律。本实验通过水培的方式，通过对典型湿地植物香蒲的整个生长周期（生长期、繁殖期、枯落期）的铁膜形成量、铁膜吸附As及香蒲根系As含量进行动态监测，探究在两种P质量浓度下（0.2、2 mg·L−1）香蒲根表铁膜的形成及其吸附 As的规律与特征，对于受污染湿地的植物修复有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验设计

供试植物为典型的湿地植物香蒲，购自云南省昆明市富民泛亚苗圃植基地，选取当年高度一致（株高约15 cm）、长势良好且生长状况一致的幼苗作为实验材料。挑选出生长一致的幼苗移栽到1.5 L的塑料桶中，共计18桶，每桶3株幼苗，每个桶中供应Hoagland营养液，体积为1 L。营养液组分为 NH4NO3114.3 mg·L−1、NaH2PO4·2H2O 50.4 mg·L−1、K2SO489.3 mg·L−1、CaCl2158.2 mg·L−1、MgSO4·7H2O 40.5 mg·L−1、MnCl2·4H2O 7.5 mg·L−1、(NH4)6Mo7O24·2H2O 0.37 mg·L−1、H3BO34.62 mg·L−1、ZnSO4·7H2O 0.175 mg·L−1、CuSO4·5H2O 0.155 mg·L−1、Fe-EDTA 1.128 mg·L−1。营养液 pH值调至 5.0，每个星期更换一次营养液，待香蒲生长成熟之后在每个桶内加如20 mg·L−1的Fe-EDTA作为铁源。以Na2HAsO4·7H2O为As源，以KH2PO4作为P源。

分别设置 0、2、10 mg·L−13个 As质量浓度，设置0.2、2 mg·L−1两个P质量浓度进行交叉实验，分别记为 As0P0、As0P0.2、As2P0、As2P0.2、As5P0、As5P0.2

香蒲自2019年4月22日购置移栽水培，适应性培育15 d后加入外源As、P之后继续培养60 d，分别在生长期（7月7日）、繁殖期（9月7日）、枯落期（11月7）采集植株样品进行相关分析（以香蒲实际生长情况来划分3个不同时期）。

1.2 铁膜及其吸附砷、植物根系砷、根系活力测定

将植株从营养液中取出，用去离子水冲洗3次，然后从茎基部将香蒲根系和地上部分开，地上部装入袋中。根系用DCB（dithionite-citrate-bicarbonate method）法提取根表铁膜中Fe、As，具体方法为：将用去离子水洗干净后的水稻根系放入 150 mL三角瓶中，加入 0.3 mol·L−1的 Na3C6H5O7·2H2O 40 mL，1 mol·L−1NaHCO35 mL，3 g Na2S2O4，振荡 3 h（Haold et al.，2004），溶液转移至100 mL容量瓶中定容，将定容后的浸提液分为两部分，一部分使用火焰光度计测定其中铁含量，一部分使用原子荧光光度计测定砷含量。使用经DCB浸提之后的根系，先用去离子水洗净，然后使用浓硝酸-高氯酸-盐酸进行消煮，使用原子荧光法测定消煮液中的砷含量，即为去除铁膜后的根系砷含量。根表铁膜形成量、砷吸附量、根系中砷含量的计算方式参考黄颖等（2020）的研究。

采用TTC法对窄叶香蒲的根系活力进行测定，具体方法为：称取洗净根尖样品0.5 g，放入10 mL烧杯中，加入0.4% TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10 mL，把根充分浸没在溶液内，在37 ℃下暗保温 1—3 h，此后加入 1 mo·L−1硫酸 2 mL，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸与根样品，10 min以后再加其他药品，操作同上）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3—4 mL和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲攒。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2、3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10 mL，用分光光度计在波长485 nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。

式中，W为四氮唑还原强度（mg·g−1·h−1）；a为四氮唑还原量（mg）；b为根重（g）；c为反应时间。

1.3 数据分析与计算

图表制作采用Origin 2015，所有结果为3次平行试验数据的平均值，差异显著性和相关性分析采用IBM SPSS Statistics 25（Duncan法）进行检验，统计显著性设为P＜0.05。铁膜及其吸附As含量的计算，先测出浸提液中 Fe、As的浓度计算出浸提液中Fe、As的质量除以浸提时根的干质量。

2 结果与分析

2.1 砷胁迫对植物株高与生物量的影响

由图1可知在不同生长期As对植物株高的影响不同，在生长期的同一P质量浓度处理下香蒲的株高为 0 mg·L−1As＞5 mg·L−1As＞2 mg·L−1As；在繁殖期的 0.2 mg·L−1P 组株高的变化规律为 10 mg·L−1As＞2 mg·L−1As＞0 mg·L−1As，0.2 mg·L−1P 组为 2 mg·L−1As＞0 mg·L−1As＞10 mg·L−1As；在枯落期的0.2 mg·L−1P 组株高的变化规律为 0 mg·L−1As＞2 mg·L−1As＞10 mg·L−1As，2 mg·L−1P 组为 2 mg·L−1As＞0 mg·L−1As＞10 mg·L−1As。由表 1 可知，在不同外源 As浓度下，在不同生长时期的香蒲生物量均产生显著性差异，仅在外源P为0.2 mg·L−1的繁殖期与2 mg·L−1的生长期未见显著性差异。这一结果表明，在低外源P情况下一定浓度的As胁迫在生长期和繁殖期有利于植物生长，在本实验中的两种P浓度下As胁迫都会对植物生长产生一定影响。

表1 砷胁迫下不同生长时期香蒲生物量（鲜质量g）Table 1 Cattail biomass at different growth stages under arsenic stress

图1 砷胁迫下不同磷质量浓度香蒲株高Fig.1 Plant heights of cattails with different phosphorus concentrations under arsenic stress

2.2 不同生长期香蒲根表铁膜生成量

如图2a所示，当不存在As胁迫的情况下在低P（0.2 mg·L−1）和高 P（2 mg·L−1）两组质量浓度下，不同的生长时期根表铁膜的生成量是有一定的差异。其中最大的生成量均为生长期量为 2963.83mg·kg−1和 1176.63 mg·kg−1；最小值为枯落期生成量为 746.77 mg·kg−1和 553.66 mg·kg−1。通过显著性分析的结果可知，在低P组铁膜的生成量仅生长期的数值与其他两个时期的存在差异，繁殖期和枯落期的不存在显著性差异。在高P组3个生长时期的铁膜生成量都存在显著性差异。当 As胁迫质量浓度为 2 mg·L−1时铁膜的生成量的最大值分别为1558.29、886.13 mg·kg−1为香蒲的生长期；铁膜生成量的最小值分别为 379.13、306.14 mg·kg−1为香蒲的枯落期。在两组不同外源P浓度下铁膜的生成量仅在生长期有显著性差异，在繁殖期和枯落期的生成量不存在显著性差异。在As胁迫质量浓度为10 mg·L−1时在生长期铁膜的生成量有最大值分别为2411.57、799 mg·kg−1；在枯落期有最小值分别为227.00、206.32 mg·kg−1。通过对数据进行显著性分析可知在低P条件下生长期、繁殖期、枯落期的生成量都存在显著性差异，在高P条件下仅生长期的存在显著性差异，繁殖期和枯落期的生成量不存在显著性差异。

图2 不同质量浓度As处理根系铁膜生成量Fig.2 Iron film production of root treated with different concentrations of As

通过对比分析As质量浓度为0、2、10 mg·L−13组情况下不同时期根表铁膜的生成量的情况可知，无论是何种As浓度和不同P浓度下，根表铁膜的生成量在不同时期都有所不同，其规律为生长期＞繁殖期＞枯落期，其中在某些As浓度和P浓度下繁殖期和枯落期的生成量不存在显著差异。

2.3 两组外源磷浓度对香蒲根表铁膜生成的影响

通过分析和对比在低P和高P两个不同浓度的铁膜生成量（图3），可知在外源P浓度较低时，是有利于铁膜的生成。在低P浓度下铁膜的最大生成量为 2753.62 mg·kg−1，平均值为 1085.72 mg·kg−1，最小生成量为227.69 mg·kg−1。在高P浓度下铁膜的生成量较低且分布的范围也较窄，其生成的范围为 1176.63—206.32 mg·kg−1，远小于在低 P 浓度下的范围 227.69—2753.62 mg·kg−1。且低 P 条件下铁膜的平均生成量越要高于高P浓度。这一结果表明在不同外源 P条件下铁膜的生成量是有明显差异的，且差异十分显著。这一实验结果与在其他植物中进行的实验的结果基本一致，即铁膜的生成量与环境中的P浓度有着十分显著的关系，在其他植物中的（实验）结果为低P可促进植物根表铁膜的形成，高P会抑制植物根表铁膜的形成。

图3 不同P浓度下香蒲根表铁膜生成量Fig.3 The amount of iron film generation of the fennel surface under different P concentrations

2.4 香蒲根系活力与根表铁膜生成

通过分别测量香蒲在繁殖期和枯落期两个时期的根系活力（图4、5），对比分析在0.2 mg·L−1P和2 mg·L−1P两组不同外源P输入下香蒲的根系活力可知，随着As胁迫的增加在高P浓度下根系活力会随之下降，在低P浓度下的变化规律为先下降后上升但根系活力最高的点均为无 As胁迫时。这一结果也表明 As胁迫会对香蒲的生长有一定的毒害作用，且一定量外源P的加入有利于减轻此种毒害。通过对根系活力和根表铁膜生成量进行相关性分析可知，二者呈现出正相关关系（P=0.784，r2=0.615），这表明在本实验体系中香蒲根表铁膜的生成量与其根系活力有一定的关系。根系活力高的植物可在根系周围形成局部的氧化环境，增强根系的呼吸强度，从而促进Fe2+等还原物质在根际进行氧化反应，使得根表铁膜生成量增加。

图4 繁殖期根系活力Fig.4 Root activity in breeding period

图5 枯落期根系活力Fig.5 Root activity in dead leave period

2.5 根表铁膜吸附砷的能力

由于香蒲根表铁膜吸附的As、P的含量与香蒲铁膜的形成量有着很明显的关系，呈现出正相关，直接用铁膜上富集的As含量来反映铁膜对于As的吸附无法准确地反映其吸附能力，故通过计算DCB浸提液中As与Fe的浓度比（As/Fe）作为衡量植物根表铁膜吸附As，也可以避免同一处理的香蒲植株形成不同铁膜量造成的吸附差异，从而真实地反应出不同生长时期以及在不同外源砷作用下香蒲根表铁膜对于砷的吸附能力。

表 2 为 As胁迫浓度为 2 mg·L−1时的 As/Fe，通过显著性分析的结果可知，在不同生长期和不同外源P处理下As/Fe都有显著性差异。在两组外源P处理下As/Fe的大小都为枯落期＞生长期＞繁殖期；在生长期和枯落期时，0.2 mg·L−1P时的 As/Fe＞2 mg·L−1P时的As/Fe，而繁殖期结果相反。通过以上结果可知在As浓度为2 mg·L−1中根表铁膜对环境中As的吸附能力主要受生长时期和外源P浓度这两个因素的影响。表3为As胁迫浓度为10 mg·L−1时的 As/Fe。通过对计算结果分析可知，在两组不同外源P浓度下As/Fe的大小都是繁殖期＞枯落期＞生长期且在 3个不同的生长时期 As/Fe均为 2 mg·L−1P＞0.2 mg·L−1P。通过对数据进行显著性分析的结果可知在不同生长期和不同外源P处理下都存在显著性差异，这一结果说明在香蒲不同生长时期和不同P处理下都会对根表铁膜吸附As的能力有一定的影响。

表 2 2 mg∙L−1 As处理时 As/Fe比率 As/FeTable 2 As/Fe ratio at 2 mg·L−1 As treatment

表3 10 mg·L−1 As处理时As/Fe比率Table 3 As/Fe ratio at 10 mg·L−1 As treatment

2.6 砷在根表铁膜与根系中的分配

通过计算在低P和高P两种P浓度下As在根表铁膜和根系内的分配比例可得到，在不同的生长时期以及不同的 As浓度下，砷的分配比例结果是有一定的差异性和特征规律的。

如图6在P浓度为0.2 mg·L−1时，在生长期外源As浓度为0 mg·L−1时，根系中的As分配比率超过40%，达到65%左右，在繁殖期和枯落期较低，As浓度处理下As在根系中分配比率都低于40%，最高的为枯落期的As浓度为0 mg·L−1时，比率为47%左右，最低的为生长期As浓度为2 mg·L−1，比率为10%。在不同的生长时期这一分配比率都有所不同。在 P浓度为2 mg·L−1时，在生长期外源As浓度为 0 mg·L−1时，根系中的 As分配比率超过40%，达到 49%左右，在其他 As处理和不同生长期内，As在根系中的分配比率都低于 40%，在生长期内最低的为10 mg·L−1，分配比率低于10%，在2 mg·L−1处理下的分配比率也低于10%；在繁殖期As的分配比率都低于20%，最低的为砷浓度10%，在As浓度为2、10 mg·L−1时相差不大；在枯落期最低的为2 mg·L−1，比率为10%。通过对比在相同生长时期和相同As处理下高P和低P两组情况下As在根系和铁膜中的分配比率可知，在生长时期和As处理相同的情况下，高P组处理下As在根系中的分配比率都有低于低P处理，这一结果直接表明了外源添加 P可以有效抑制香蒲对于环境中的 As的吸附。在不同生长时期，As在根系和铁膜中的分配比率都有很大不同，没有呈现出一个明显的规律。这一结果表明，在不同的生长时期和不同的As处理下，香蒲根系对于As的吸附能力有一定的差异性，在本试验体系中影响这一能力的主要因素为香蒲的生长时期和外源As的浓度。

图6 As在根系和铁膜的分配比Fig.6 As distribution ratio in root system and iron film

3 讨论

3.1 砷磷作用下不同生长时期香蒲生长与根表铁膜生成量

As是植物生长不需要的有毒痕量元素，影响正常生理代谢（陈国梁等，2017），已有研究证明，低浓度As作用下对植物的生物量积累会有一定程度的促进作用，但这种刺激存在阈值，超出后会抑制植物生长（陈天等，2019）。在本试验中两组外源P浓度输入下不同浓度的As胁迫对植物生长都有显著影响，在外源P浓度为0.2时As对植物的生长都表现出抑制，在外源P浓度为2 mg·L−1时则出现出一定的促进作用。由于As和P化学性质相似，最外层电子数相同，在晶体结构中可互相代替，所以当外源P浓度较高时对环境中的 As胁迫是有一定的缓解作用。通过分析低P和高P两组P浓度下不同生长时期下香蒲根表铁膜的变化规律可知在不同生长时期根表铁膜的生成量也有一定的差异（王丹等，2015），其规律为生长＞繁殖期＞枯落期，其中生长期的形成量与繁殖期、枯落期有着显著差异，繁殖期与枯落期差异不显著。根据对香蒲繁殖期和枯落期根系活力的研究表明根系活力与根表铁膜的形成呈现正相关。综合分析表明，香蒲根表铁膜的含量是一个动态的变化过程，随着植物的生长时期不同，根系活动强弱也不同（钟顺清，2015），从而导致这一结果。根系活力是评价包括根系呼吸作用在内的根系代谢状况的指标之一，在一定程度上可以反映根系释放出氧化性物质的情况（刘振国等，2016）。在对两种P浓度下铁膜形成量的分析比较可知，在低P条件下植物形成根表铁膜的能力是高于高P条件下的，这一结果与其他植物中低P促进形成高P抑制形成的（实验）结果一致。在本实验中铁膜的生成量与环境中的P浓度有着十分显著的关系，在其他植物中的（实验）结果为低P可促进植物根表铁膜的形成，高P会抑制植物根表铁膜的形成，在本实验体系中也得到了一致的结果（傅友强等，2014）。

3.2 砷磷作用下香蒲根表铁膜对砷的吸附能力

通过计算和分析As/Fe比可知，在不同的生长时期和不同的外源砷作用下香蒲根表铁膜对于 As的吸附能力是有一定的区别的，产生这一区别的原因主要是在香蒲不同的生长时期对于营养物质的吸收以及香蒲本身的生长状况有关，As/Fe的值在不同生长时期是有显著性差异的。通过方差分析的结果（表4）可知，在低P条件下影响根表铁膜吸附As的能力的主要因素为生长时期，在高P条件下的主要影响因素为不同的 As浓度，但不同生长时期和不同P浓度的交互作用在两组P浓度下都会产生影响。这一结果出现的原因与As、P处于同一主族元素，在根表铁膜吸附这两种元素的过程中存在竞争（杨忠兰等，2020）。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

3.3 砷在根表铁膜与植物的分配

在分析两种P浓度下As在根表铁膜和根系的分配比率可知，除去生长期外源 As、P浓度为 0 mg·L−1时根系中的 As分配比率高于铁膜中的分配比率，在其他组别中根系砷的分配比率都要低于铁膜As。这表明，根表铁膜的形成的确有利于香蒲抵御As胁迫，对于环境中的As有较强的吸附能力从而减少了As进入植物体内，进而减缓了As对于植物生长的影响。根系通气组织发达的根系可产生更多的氧气和氧化性分泌物，有利于形成更多的根表铁膜，进而使根表铁膜中富集更多的As（张秀等，2013）。在对比低P和高P两个组别的分配比率发现，高P组中砷在根系中的分配比率都要低于低P组，这一结果也表明P的添加会减缓植物对于砷的吸收，从而降低的植物根系中砷的含量。由于As、P为同一主族元素，结构相似，在植物吸收时共用一个细胞通道，所以在植物吸收时二者处于一个竞争状态，当环境中的P含量上升时，也会减少植物对于As的吸收（陈同斌等，2002；陈璐等，2015；陈国梁等，2017；徐水萍等，2019）。

4 结论

在不同的生长时期，香蒲根表铁膜的形成量是有明显的差异性，这一结果表明在香蒲的全生长周期，铁膜的生成量是一个动态的变化而非静态的量，在不同的生长时期和香蒲的不同生理状态下也会产生变化，外源P对于铁膜的生成量的影响表为低促高抑。香蒲根表铁膜对于 As的吸附能力是与环境中的P含量以及生长时期有关，也与环境中的As浓度有关，其具体变化规律在本实验中未有体现，需要进一步实验研究。根表铁膜的形成有利于香蒲抵御外界As胁迫，且绝大多数的As都会吸附于铁膜表面，减少 As通过根系进入植物体内的量从而减缓对植物的毒害作用。