乳粉中脂肪成分分析标准物质的研制

安巧云，魏敏，周剑，柴艳兵，张耀广，王梦，曹玉兰，李兴佳

(1.君乐宝乳业集团，农业农村部乳品质量安全控制重点实验室，石家庄 050021；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081)

乳粉及乳制品在食品中的重要性日趋明显，乳制品行业也一直是我国民生的重要产业［1］，其中，脂肪是膳食能量的重要来源，但摄入过多脂肪也会造成肥胖症，故脂肪含量成为了乳粉的重要检测项目［2–4］。稳定性良好的脂肪标准样品对于保障测定结果的准确性起着关键作用，在乳制品检验中也发挥着重要意义。国内外该标准物质应用范围日益广泛［5–6］。经国家标准物质研究中心网站查询，目前乳粉中脂肪成分分析标准物质仍很欠缺。企业实验室需要大量购置进口标准物质，既增加了成本，又使标准物质行业受制于人，不利于行业的发展。因此开发乳粉中脂肪成分分析标准物质有着重要的意义。

基体标准物质通常是包含被分析物的真实样品，它们以自然形式存在于自然环境中，应选择与测试样品基体相似的基体标准物质，并准确定值。Gandra等［7］研制了全脂乳粉中水分、灰分、脂肪标准物质；杨轶眉［8］采用充氮密封的方式研制了婴幼儿配方奶粉中脂肪成分分析标准物质。笔者采用真空密封及辐照处理，进一步改善了标准物质的稳定性。定值方法的建立基于GB 5009.6—2016 《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》第三法［9］，原理是用无水乙醚和石油醚抽提样品的碱（氨水）水解液，通过蒸馏或蒸发去除溶剂，测定溶于溶剂中的抽提物的质量。标准物质定值采用6家乳制品检测相关或行业权威的实验室联合定值，并对标准物质进行了均匀性、稳定性检验及不确定度评估［10–11］，确保在使用过程中量值准确可靠［12–13］。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

电热恒温水浴锅：HWS–26型，上海一恒科学仪器有限公司。

鼓风干燥箱：XT5118M–OV240型，杭州雪中炭恒温技术有限公司。

三维混匀机：KSH-50型，北京锟捷玉城机械设备有限公司。

电子天平：ME204E，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒公司。

乙醇、无水乙醚、石油醚、刚果红、盐酸：分析纯，天津永大化学试剂有限公司。

乳粉：君乐宝乳业有限公司。

氨水：分析纯，石家庄市试剂厂。

1.2 标准物质定值方法

称取1.0 g乳粉样品置于抽脂瓶中，加入10 mL 60 ℃的水，充分混合。加入2.0 mL氨水，充分混合后立即将抽脂瓶放入60 ℃的水浴中，加热20 min，不时取出振荡，静置30 s。取出，冷却至室温。加入10 mL乙醇，缓慢地混合均匀（采用手摇式混匀，盖上抽脂瓶塞，缓慢倾斜抽脂瓶，使抽脂瓶小球中的液体完全倾出，再使抽脂瓶恢复到垂直状态，为一次混匀，反复此操作5次以上可达到彻底混匀的目的）。加入25 mL乙醚，轻轻振荡摇匀。加入25 mL石油醚，轻轻振荡摇匀。将抽脂瓶静置至少30 min，直到上层液澄清，并明显与水相分离。将上层液尽可能地倒入已准备好的加入沸石的脂肪收集瓶中，避免倒出水层进入抽脂瓶中。加入5 mL乙醇，用15 mL无水乙醚和15 mL石油醚，进行第2次抽提。用15 mL无水乙醚和15 mL石油醚，进行第3次抽提。合并所有提取液，于沸水浴上蒸发至干来除掉溶剂。将脂肪收集瓶放入(100±5)℃的烘箱中干燥1 h，取出后置于干燥器中冷却0.5 h后称量。重复以上操作至恒重(直至两次称量的差不超过2 mg)。

1.3 标准物质制备

标准物质候选物原料为与日常检测水平相当的乳粉，经过三维混匀机混匀，用避光铝箔袋真空密封封装，按5 g／袋包装，共包装800个单元，按辐照剂量为5.5 kGy，辐照时间为4 h进行辐照，于–20 ℃冷冻保存。

1.4 均匀性和稳定性检验

1.4.1 均匀性检验

根据JJG 1006—1994 《一级标准物质技术规范》和JJF 1343—2012 《标准物质定值的通用原则及统计学原理》［14–15］的要求，从标准物质的包装中随机抽取25个单元，做标准物质均匀性统计检验，每个单元中最小取样量为1.00 g，平行取3次，检验方法与基体标准物质定值方法相同。

1.4.2 稳定性检验

标准物质的稳定性检验包括长期稳定性检验和短期稳定性检验，长期稳定性检验按先密后疏的原则，分别在第0、1、2、4、6月进行稳定性检验，实验方法与定值方法相同，每次取二个独立包装，每个包装取平行测定3次。

短期稳定性检验根据模拟运输条件，将样品置于4 ℃和50 ℃下，分别在第0、1、3、5、7天进行稳定性监测，实验方法与定值方法相同。

1.5 标准物质联合定值及数据处理

联合6家实验室按1.2定值方法进行定值。数据处理为用达戈斯提诺法考察所有数据的正态性，用狄克逊检验法考察离群值，用科克伦检验法考察是否等精度。

2 结果与讨论析

2.1 均匀性检验

对随机抽取的25个单元进行测定，结果见表1。用F检验法对均匀性检验结果做方差分析，通过组间方差和组内方差的比较来判断不同单元中乳粉中脂肪含量的测量值之间有无系统性差异。从表1数据计算得F=1.05，查表得F临界值F0.05(24,50)=1.86，F＜F0.05(24,50)，表明组内与组间无明显差异，满足国家标准物质的要求，说明样品是均匀的。

表1 乳粉中脂肪分析标准物质均匀性检验结果

2.2 稳定性检验

稳定性检验以时间x为纵坐标、乳粉中脂肪测定值y为横坐标，以检测时间和结果拟合直线，采用趋势分析法，对稳定性检验结果统计分析。

长期稳定性检验数据见表2，拟合直线为y=0.000 064x+26.476，其中斜率β1=0.000 064，截距β0=26.476。

表2 乳粉中脂肪分析标准物质长期稳定性检验结果

由表2数据计算得s(β1)=0.000 106 6，自由度为n–2、置 信 水 平 为95%的t因 子t0.95，n–2=3.18。t0.95，3s(β1)=3.18×0.000 106 6=0.000 338 842 88。

因为|β1|=0.000 064，|β1|＜t0.95，3s(β1)，因此说明乳粉中脂肪分析标准物质在该包装储存条件下，6个月内是稳定的。

短期稳定性检验同样采取趋势分析法对4 ℃和50 ℃的稳定性检验结果统计分析，结果见表3。

表3 乳粉中脂肪分析标准物质短期稳定性检验结果

4 ℃储存条件下得到的拟合直线为y=0.000 271x+26.305，其中斜率β1=0.000 271，截距β0=26.305。由表3数据计算 得s(β1)=0.000 097 9，t0.95，3s(β1)=0.000 311 460 29，|β1|＜t0.95，3s(β1)，说明4 ℃条件下乳粉中脂肪分析标准物质在7天内稳定的。

50℃储存条件下得到的拟合直线为y=–0.000 18x+26.368，其 中 斜 率β1=0.000 18，截 距β0=26.368。由表3数据计算 得s(β1)=0.000 097 9，t0.95，3s(β1)=0.001 204 116，|β1|＜t0.95，3s(β1)，说明50 ℃条件下乳粉中脂肪分析标准物质在7天内是稳定的。

2.3 标准物质联合定值结果

乳粉中脂肪分析标准物质6家实验室定值结果列于表4，6家实验室测定结果的总平均值为26.5%。

表4 乳粉中脂肪分析标准物质联合定值结果

2.3.1 正态检验

对所有数据进行正态D检验法(达戈斯提诺法)，得D值为0.273 1，大于临界值0.271 7，因此该组数据符合正态分布。

2.3.2 异常值检验

根据GB／T 4883—2008 《数据的统计处理和解释–正态样本离群值的判断和处理》［16］，采用狄克逊准则对各实验室定值数据进行统计检验，将定值结果按照由小到大的顺序排序：X1=26.11，……Xn–2=26.85，Xn–1=26.87，Xn=26.88，n=54，由狄克逊检验表查ƒ(0.05，54)=0.32，r1和rn均小于ƒ(0.05，54)，故全部数据均应保留。

2.3.3 等精度检验

6家实验室均采用碱水解法作为定值方法，采用科克伦法检验平均值间是否等精度，先计算6组数据中每组9个数据的方差，再计算其中的最大方差与6组方差和之比。

根据科克伦检验准则，计算统计量6组方差和为0.024，其中最大方差与6组方差和之比：

查表得C(0.05，6，9)=0.381 7，C＜C(0.05，6，9)，表明各平均值间为等精度。

因此，以6家实验室测定结果的总平均值作为本标准物质乳粉中脂肪定值结果w=26.5%。

2.4 不确定度评定

脂肪基体标准物质的不确定度来源由三个部分组成：（1）标准物质定值引入的不确定度；（2）测量方法引入的不确定度；（3）标准物质均匀性引入的不确定度；（4）标准物质稳定性引入的不确定度［17–19］。

2.4.1 定值引入的不确定度

由于本研究工作采用碱水解法，其它合作定值单位也采用了碱水解法独立测量，经柯克伦检验和迪克逊检验数据无异常值，最终定值结果为6家实验室的合作定值结果，将这6组实验室的平均值w作为一组新的数据，则：

2.4.2 测量方法引入的不确定度

根据结果的计算过程，在定值过程中主要是称量参与结果计算，B类不确定度主要由以下几个部分引入：测量结果重复性；涉及称量共5次，m、m1、m2、m3、m4分别为样品质量、恒重后脂肪收集瓶和脂肪的质量、脂肪收集瓶的质量、空白实验中恒重后脂肪收集瓶和抽提物的质量、空白实验中脂肪收集瓶的质量。需要考虑的质量分量包括m、m1、m2、m3、m4，其中m是二次称量，m2、m4都是一次称量得到而只考虑天平的校准，m1、m3不仅考虑天平的校准还要考虑恒重的问题。

m2、m4引入的不确定度只需考虑天平的校准，按照检定证书给出天平校正产生的不确定度为0.5 mg（k=2），则um2=um4=0.5／2=0.25 (mg)，在 脂肪一次检测过程中，m1=70.277 3 g，m2=70.012 2 g，m3=70.682 3 g，m4=70.682 2 g。

2.4.3 均匀性引入的不确定度

标准物质的不均匀性以独立测定平行实验来表示，即以瓶间和瓶内均匀性检验结果的相对准偏差SH表示。

由表1均匀性试验结果得出：瓶间方差Q1=0.004 172，瓶内方差Q2=0.008 247 9。

均匀性引入的相对不确定度：

ubb,rel=ubb／w=0.000 18／(26.5%)=0.065%

2.4.4 稳定性引入的不确定度

脂肪乳粉基体标准物质长期稳定性引入的不确定度根据表2数据计算：

ults=st=s(β1)t=0.000 106 6×6=0.000 64

脂肪乳粉基体标准物质长期性稳定性实验引入的相对不确定度：

ults,rel=0.000 64／(26.5%)=0.241%

短期稳定性引入的不确定度根据表3按50℃的数据计算：

usts=st=s(β1)t=0.000 378 7×7=0.002 65

短期稳定性引入的相对不确定度按50℃的数据计算：

2.4.5 标准物质的合成不确定度

以上各不确定度分量互不相关，则标准物质定值结果的合成不确定度：

扩展不确定度：

UCRM=UCRM,relw=(2.160%)×(26.5%)=0.6%

2.5 定值结果

乳粉中脂肪分析标准物质定值结果：

3 结语

研制了乳粉中脂肪成分分析标准物质，其定值结果为26.5%，扩展不确定度为0.6%。该基体标准物质获批为国家二级标准物质，可用于方法评价确认，实验室质控样品等，为我国乳品质量安全检测提供有力的保障手段。