益气活血方对肝纤维化大鼠JNK通路的作用研究*

石家庄市中医院脾胃科

孟 萍 南月敏△(石家庄 050051)

提要 目的：研究c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号转导通路在CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型中的表达，以阐明益气活血方抑制肝纤维化的分子机制。方法：27只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和益气活血方治疗组。模型组以30%CCl4 橄榄油溶液腹腔注射诱导建立肝纤维化模型；益气活血方治疗组在CCl4 建模的同时以益气活血方灌胃进行干预实验；对照组腹腔注射橄榄油溶液。检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平；分别采用RT-PCR及Western Blot法检测大鼠肝组织JNK信号通路中JNK、c-Jun mRNA表达及其磷酸化产物p-JNK、p-c-Jun蛋白表达。结果：模型组大鼠血清ALT、AST水平、肝组织JNK、c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表达增高，与对照组相比差异有显著性，而益气活血方治疗组可显著降低ALT、AST、c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表达水平(P均<0.05)。结论：益气活血方通过抑制JNK信号转导通路的活化，从而延缓肝纤维化进展。

肝纤维化是肌体对慢性损伤的主动修复反应，以细胞外基质(ECM)异常沉积为特征。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶家族的重要成员，研究证实，JNK信号通路在肝纤维化发生发展中发挥重要作用[1]。笔者的前期研究发现[2-4]，益气活血方可调节肝细胞自噬，抑制肝星状细胞(HSC)活化及ECM沉积，促进胶原降解，并能抑制死亡受体途径FasL/Fas的激活，上调线粒体途径Bcl-2/Bax比例，抑制细胞凋亡，发挥阻止及延缓肝纤维化的作用，但其对JNK信号转导通路的影响尚不十分清楚。笔者以CCl4建立大鼠肝纤维化模型，并应用益气活血方进行治疗研究，观察JNK信号通路因子的表达变化，为益气活血方在临床应用于抗肝纤维化的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立 清洁级雄性Wistar大鼠27只，体质量180～220 g，来源于河北医科大学实验动物中心。随机分为3组：对照组9只，腹腔注射橄榄油(0.2 mL/100 g)，2次/周，并以生理盐水灌胃(1 mL/100 g)，1次/d；模型组9只，腹腔注射30%CCl4橄榄油溶液，同样以生理盐水灌胃；益气活血方治疗组9只，腹腔注射30%CCl4橄榄油溶液，以自拟益气活血方(黄芪、丹参、云茯苓、白豆蔻、郁金等)免煎颗粒剂溶液(免煎颗粒由江苏省江阴天江药业有限公司提供)灌胃。喂养8周后深度麻醉下处死大鼠，留取血清，备行肝脏生化检测；剖腹取肝脏，用液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存，用于提取mRNA及蛋白。

1.2 肝功能指标检测 应用迈瑞BS-800M全自动生化分析仪检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。

1.3 肝组织JNK通路因子JNK、c-jun mRNA表达 采用实时定量RT-PCR法。Trizol一步法提取肝组织总RNA，逆转录合成cDNA。以适量cDNA为模板，GAPDH为内参照，进行实时定量扩增。每个基因重复操作3次，运用2-△△CT法分析结果。依据Genbank设计引物序列，由上海生物工程公司合成，具体序列详见表1。

表1

1.4 肝组织JNK通路因子JNK、p-JNK、p-c-Jun蛋白表达 取肝组织20 mg，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性后，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭1 h，分别与兔抗GAPDH(美国Affinity公司)、兔抗JNK、p-JNK、p-c-Jun抗体(英国Abcam公司)反应，4 ℃孵育过夜。洗涤后加入第二抗体，室温孵育1 h再洗膜。使用化学发光试剂检测，X光片显影。应用Quantity One软件分析目的蛋白条带灰度值，所测结果为扣除背景的积分光密度。

2 结果

2.1 益气活血方对大鼠血清ALT、AST水平的影响 如表2所示，模型组大鼠血清ALT、AST水平均较对照组显著增高(P均<0.001)；益气活血方治疗组大鼠血清ALT、AST水平均明显低于模型组(P均<0.001)，差异具有非常显著性。

表2 实验大鼠血清ALT、AST水平变化

2.2 益气活血方对大鼠肝组织JNK信号通路JNK、c-Jun mRNA表达水平的影响 如表3所示，与对照组相比，模型组大鼠肝组织JNK和c-Jun mRNA表达水平显著增加(P分别<0.05，<0.01)；而益气活血方组c-Jun mRNA水平较模型组明显下降(P<0.05)，JNK mRNA 2组间无明显差异(P>0.05)。

表3 实验大鼠肝组织mRNA表达变化

2.3 益气活血方对大鼠肝组织JNK信号通路JNK、p-JNK、p-c-Jun蛋白表达水平的影响 如图1、表4所示，同对照组相比，模型组大鼠肝组织p-JNK和p-c-Jun蛋白表达水平显著增加(P均<0.001)；而益气活血方组p-JNK、p-c-Jun蛋白水平较模型组明显下降(P均<0.001)。各组JNK蛋白表达水平差异无显著性(P>0.05)。

图1 实验大鼠肝组织JNK、p-JNK、p-c-Jun蛋白表达变化

表4 实验大鼠肝组织蛋白表达变化

3 讨论

肝纤维化是多种慢性肝病向肝硬化发展的中间病理阶段，伴随ECM合成增多、降解减少致ECM大量堆积，而HSC是肝纤维组织中ECM的主要来源[5]。肝纤维化若不及时治疗，将进一步转化为肝硬化甚至肝癌，严重降低患者的生活质量甚至威胁生命。因此，肝纤维化成为预防和治疗肝硬化以及肝癌发生的关键点。

本研究中，CCl4诱导的模型组大鼠血清ALT及AST水平显著增高。当肌体摄入一定量的CCl4，产生大量的亲电子基、自由基等活性代谢物，引起膜脂质过氧化，损伤肝细胞，导致细胞质内ALT和AST释放入血液[6]。而应用自拟益气活血方干预， ALT及AST水平显著降低，表明益气活血方减轻了CCl4对肝脏的损伤，具有保肝、抗肝损伤的作用。益气活血方中：⑴黄芪具补气扶正、固表利水之效，可改善肝组织的氧化应激及脂质过氧化损伤的程度，抑制肝细胞凋亡，可有效抗肝损伤[7]；⑵云茯苓和胃健脾、利水渗湿，可改善肝脏的微循环，抑制ECM的合成[8]；⑶郁金具有活血行气、凉血解郁、利胆退黄的功效，可降低HSC的胶原蛋白分泌功能，诱导HSC发生细胞凋亡[9-10]；⑷丹参和白豆蔻活血化瘀、温中行气、化湿健脾，可下调肝组织转化生长因子β表达，抑制ECM合成，起到延缓肝纤维化的作用[11-12]。

JNK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可由3个基因编码，分别为JNK1、JNK2及JNK3，可转导细胞外刺激信号致细胞内，多途径、多靶点调控包括炎症反应、细胞分化、增殖、凋亡、应激反应等生理活动[13]。c-Jun蛋白是JNK蛋白激酶的重要底物，活化的JNK可进一步激活c-Jun，调控相关基因转录，发挥生物学作用[14]。本研究从mRNA及蛋白表达角度显示，模型组大鼠肝组织JNK、c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表达较对照组显著增加，提示JNK活化，并激活c-Jun，可作为肝纤维化发生发展的重要机制之一；而应用益气活血方能显著抑制c-Jun mRNA及p-JNK、p-c-Jun蛋白表达的上调，提示益气活血方能抑制JNK及其下游c-Jun的激活，进而延缓或阻止肝纤维化。研究证实，多种细胞因子可通过JNK信号通路激活HSC[15]，促进肝纤维化的进展，应用JNK特异阻断剂可抑制HSC增殖[16]，有效抗肝纤维化。与作者的结果相同，中药芝麻素可抑制受损肝细胞JNK的表达，进而抑制转录因子c-Jun磷酸化，阻止CCl4诱导的肝细胞损伤[17]。同时，吕晓梅等[18]证实CCl4致大鼠急性肝损伤模型中，模型组大鼠肝脏中p-JNK和p-c-Jun蛋白表达水平显著增加。然而，李政通等[19]发现，p-JNK1/2蛋白在肝纤维化模型组较正常组显著降低，而在肝纤维化逆转期表达增加，且p-JNK的含量与胶原蛋白主要组分羟脯氨酸(Hyp)的表达负相关，说明p-JNK与肝纤维化病变程度呈负相关性，与作者的结果相反，需要进行进一步研究予以证实。

研究证实，肝损伤与JNK信号转导通路的活化密切相关，且常伴随肝细胞凋亡的发生[20]。活化的JNK可能通过以下机制介导细胞凋亡，从而促进肝纤维化进展。(1)死亡受体途径：激活下游c-Jun、c-Fos样转录因子等，上调促凋亡蛋白P53、FasL等的表达，促进细胞凋亡[21]；(2)线粒体途径：上调促凋亡蛋白Bax表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的活性，作用于线粒体促进细胞色素C释放，从而激活胱天蛋白酶，诱导细胞凋亡[22]。

综上分析，结合课题组前期研究结果，抑制FasL/Fas系统的激活，上调抗凋亡蛋白Bcl-2/下调促凋亡蛋白Bax表达，降低JNK及其下游c-jun的表达，调控JNK信号转导通路从而减少肝细胞凋亡，可能是益气活血方减轻CCl4模型大鼠肝细胞损伤、延缓肝纤维化进展的部分作用机制。