涤痰荡瘤汤调节ERK2/ETS1/MMP9通路抑制裸鼠胃癌移植瘤生长

孙 琪，王 华，郭 维

（1.宁夏医科大学中医学院，银川 750004；2.宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，银川 750004）

中国的胃癌发病率在全球占比约40%[1]。尽管近年来死亡率有降低趋势[2]，但由于发病人数增加，胃癌依然是严重影响人民健康的恶性疾病。中药治疗胃癌能体现增效减毒，提高免疫力，改善患者生存质量等优势作用。中医理论提出胃的生理病理有两个主要特点，即“脾胃为生痰之源”“六腑以通为用，以降为顺”。基于此，本文胃癌的核心病机为“痰浊阻滞，腑气不通”，提出采用“化痰通腑法”治疗胃癌。临床中以“消痰散结方”为基础结合个人经验拟定“涤痰荡瘤汤”，该方由半夏、天南星、瓜蒌、酒大黄等药物组成，有化痰散结、通腑降气之功。临床中运用该方治疗胃癌取得较好效果，能明显改善患者症状及生活质量。

microRNA在胃癌发病过程中发挥了重要调控作用，在消化道肿瘤中microRNA-506-3p显示低表达状态，通过提高其表达可抑制肿瘤生长，对肿瘤防治有重要意义[3-4]。microRNA-506-3p可通过靶向调控胞外信号调节激酶2（ERK2）/E26转录因子1（ETS1）/基质金属蛋白酶9（MMP9）通路，进而调控肿瘤细胞的增殖和转移[5]。上述这些研究结果提示microRNA-506-3p及其调控的ERK2/ETS1/MMP9信号通路可能是药物作用的靶点。为深入阐明涤痰荡瘤汤有效抑制胃癌细胞的增殖和迁移的作用机制，本文探讨涤痰荡瘤汤对人胃癌细胞裸鼠胃原位移植瘤的抑瘤作用及其对microRNA-506-3p和ERK2/ETS1/MMP9信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂及药物 涤痰荡瘤汤药物组成：清半夏15 g，天南星15 g，瓜蒌9 g，酒大黄3 g，浙贝10 g，生牡蛎30 g，全蝎6 g，地龙6 g，守宫6 g，海螵蛸15 g，甘草9 g。上方制成浓度为0.81 g·mL-1的水煎剂（该浓度由人与小鼠给药剂量换算所得，前期预实验中通过MKN45细胞胃癌原位移植瘤模型证明该浓度为最佳抑瘤浓度，因此本实验所用中药均采用此浓度，具体见表1。由宁夏医科大学附属回医中医医院提供；注射用5-氟尿嘧啶（5-FU）（上海旭东海普药业有限公司）。

microRNANA荧光定量试剂盒（SYBR Green）购自北京天根公司；ETS1 Antibody（66598-1-Ig）、MMP9 Antibody（10375-2-AP）、Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody（66009-1-Ig）购自武汉三鹰生物技术有限公司；Erk2 Antibody（9108）购自德国CST公司；Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody HRP conjugated（L3032）、Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody HRP conjugated（L3012）购自艾克索生物科技股份有限公司；ECL发光液（RPN2232）购自美国GE公司；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基公司；蛋白Marker购自美国Thermo公司。

表1 不同浓度中药的抑瘤率（±s）

表1 不同浓度中药的抑瘤率（±s）

与空白组比较ΔP＜0.05；与低浓度组比较#P＜0.05；与中浓度组比较▲P＞0.05。

组别 中药浓度/（g·mL-1） 瘤质量/g抑瘤率/%空白组 0 4.86±0.22 —低浓度中药组 0.41 3.17±0.15Δ 34.78中浓度中药组 0.81 2.29±0.09Δ# 52.88高浓度中药组 1.62 2.21±0.05Δ▲ 54.52

1.1.2 动物及细胞SPF级无胸腺BALB/C雄性裸鼠80只，体质量（20±2）g，4～6周龄，在宁夏医科大学实验动物中心SPF级条件下饲养［许可证号SCXK（京）2016-0006］。人胃癌细胞系MKN45、BCG823来自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.2 模型制备及分组

对数期细胞配成为1×107cells/100μL细胞悬液接种于裸鼠皮下（0.2 mL/只），待瘤体长至直径约1 cm时取出瘤块切成1 mm3大小瘤块移植于另一只裸鼠皮下，等长至1 cm时根据上述过程皮下反复传代3次。裸鼠胃部接种术前禁食12 h，10%水合氯醛麻醉，皮肤消毒后切开暴露裸鼠胃部。划开幽门近胃窦血管丰富区，看到出血后将肿瘤组织（1 mm3）蘸取OB吻合胶粘合接种于此并逐层关腹，造模48 h后对60只裸鼠随机分组。因术后死亡，最终MKN45细胞动物入组数量为中药组8只（化痰散结方0.4 mL/20 g，1次/日，IG），西药组9只（5-FU 25 mg/kg，1次/2日，IP），空白组8只（生理盐水0.4 mL/20 g，1次/日，IG），BCG823细胞动物数量为中药组、西药组、空白组各9只，连续给药6周。

1.3 一般情况及肿瘤增殖、转移计算

实验前后分别称取各组裸鼠体质量，实验过程中观察裸鼠的活动度、饮食情况、精神状态和腹部情况。停药后将裸鼠处死，开腹观察肿瘤生长情况并称重。计算抑瘤率=［1-（实验给药组平均瘤重/模型对照组平均瘤重）］×100%。发现腹水、腹腔淋巴结肿大、面部肿块或其他器官肿瘤病灶中任何一项均视为转移，转移率=（本组有转移灶动物数量/本组动物总数量）×100%。

1.4 qPCR检测

qPCR技 术 检 测microRNA-506-3p、ETS1、ERK2、MMP9的mRNA基因表达，以β-actin和U6为内参。qPCR反应条件1×循环，95℃，15 min（起始模板变牲）；40×循环：94℃，20 s（PCR循环中模板变性）；60℃，34 s（退火延伸）。实验所得相关数据，以2–ΔΔCT法进行分析。引物序列见表2。

表2 引物序列

1.5 Western blot检测

Western blot技 术 检 测ERK2、ETS1、MMP9蛋白表达。动物给药结束后，Lysis Buffer缓冲液提取癌组织中蛋白质，BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白质含量。将蛋白样品加入8% SDSPAGE凝胶中分离蛋白质，分离后将蛋白转膜到PVDF膜上。转膜成功后，室温下将PVDF膜置于封闭液内2 h；4℃下置于抗体孵育盒（盒中加入稀释的一抗工作液）过夜。抗体工作液浓度为ERK2，1∶1000；TS1，1∶3000；MMP，1∶600，β-actin，1∶20000。孵育后用1×PBST洗脱3次，再用二抗孵育60 min，洗膜5次。把膜置于暗盒中，将A、B两种发光剂等体积混匀并滴加于膜上，室温反应。WB爆光仪将蛋白条带显影。Image Lab软件对条带灰度值定量分析。

1.6 统计学方法

数据采用Graphpad Prism 8.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布且方差齐性者采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法检验。检验水准α=0.05。

2 实验结果

2.1 一般情况观察

实验观察显示，MKN45空白组裸鼠饮食、活动度略差，反应迟钝，后期出现明显消瘦、弓背、腹部膨隆，取材可见腹股沟及肠系膜等腹腔淋巴结肿大，部分动物出现腹水或面部肿物，转移率63%（5/8）；中药组裸鼠饮食、活动度尚可，腹部膨隆，转移率38%（3/8）；西药组裸鼠相继出现食欲、活动度差，反应迟钝，腹部膨隆，转移率22%（2/9）。BCG823空白组饮食、活动度略差，反应略迟钝，无腹水；中药组活动度及饮食尚可，无腹水；西药组活动度及饮食较差，反应迟钝，无腹水。实验结束时测量体质量，治疗后MKN45及BCG823动物模型均显示中药组及西药组与空白组比较差异有统计学意义（P均＜0.05），中药组与西药组比较差异有统计学意义（P＜0.05），动物体质量由高到低依次是：中药组＞空白组＞西药组。与西药组和空白组比较，中药组裸鼠活动度、食欲及体质量等一般情况较好，提示中药能够改善荷瘤鼠生活质量。见表3。

表3 各组裸鼠治疗前与治疗后体质量（±s，g）

表3 各组裸鼠治疗前与治疗后体质量（±s，g）

治疗后与空白组比较ΔP＜0.05；治疗后与西药组比较▲P＜0.05。

组别 治疗前 治疗后MKN45空白组 22.3±1.50 24.9±2.33 MKN45西药组 21.8±1.05 21.3±2.47Δ MKN45中药组 21.5±1.55 28.8±2.60Δ▲BCG823空白组 21.9±1.82 25.2±2.32 BCG823西药组 21.6±1.84 22.8±2.29Δ BCG823中药组 22.1±1.39 28.9±2.98Δ▲

2.2 抑瘤率

中药组和西药组移植瘤质量与空白组相比较差异均有统计学意义（P均＜0.01）。中药组与西药组比较，移植瘤质量差异有统计学意义（P＜0.05）。MKN45组西药和中药的抑瘤率分别为60.4%和45.1%，BCG823组西药和中药的抑瘤率分别为66.6%和51.1%。见表4。

表4 各组裸鼠移植瘤质量、抑瘤率（±s）

表4 各组裸鼠移植瘤质量、抑瘤率（±s）

与空白组比较ΔP＜0.01；与西药组比较▲P＜0.05。

组别 瘤质量/g 抑瘤率/%MKN45空白组 5.13±1.25 —MKN45西药组 2.03±0.47Δ 60.4 MKN45中药组 2.82±0.53Δ▲ 45.1 BCG823空白组 3.68±0.73 —BCG823西药组 1.23±0.50Δ 66.6 BCG823中药组 1.80±0.33Δ▲ 51.1

2.3 qPCR检测

在MKN45、BCG823移植瘤中，与空白组比较，中药组和西药组microRNA-506-3p表达上调（P均＜0.01），ERK2、ETS1表达降低（P均＜0.01）；与西药组比较，中药组microRNA-506-3p表达降低（P均＜0.01），ERK2、ETS1表达升高（P均＜0.01）。在MKN45移植瘤中，三组MMP9的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。在BCG823移植瘤中，MMP9表达西药组和中药组均低于空白组（P均＜0.01），西药组低于中药组（P＜0.01）。见表5、表6。

表5 MKN45组织中各组mRNA的表达水平（±s）

表5 MKN45组织中各组mRNA的表达水平（±s）

与空白组比较▲P＜0.01；与西药组比较△P＜0.01。

组别 n中药组 8西药组 9空白组 8 microRNA-506-3p ERK2 ETS1 MMP9 1.26±0.10▲△ 1.13±0.21▲△ 1.22±0.22▲△ 1.08±0.22 1.82±0.24▲ 0.49±0.12▲ 0.52±0.15▲ 0.96±0.26 0.48±0.09 2.19±0.34 1.78±0.25 1.06±0.17

表6 BCG823组织中各组mRNA的表达水平（±s）

表6 BCG823组织中各组mRNA的表达水平（±s）

与空白组比较▲P＜0.01；与西药组比较△P＜0.01。

组别 n中药组 9西药组 9空白组 9 microRNA-506-3p ERK2 ETS1 MMP9 1.53±0.14▲△ 0.82±0.08▲△ 0.82±.08▲△ 0.87±0.09▲△1.73±0.19▲ 0.59±0.13▲ 0.57±0.14▲ 0.59±0.16▲0.34±0.15 2.01±0.28 2.07±0.32 1.99±0.29

2.4 Western blot检测

在MKN45、BCG823移植瘤中，与空白组比较，中药组和西药组ERK2、ETS1及MMP9表达降低（P均＜0.01），中药组ERK2、ETS1及MMP9表达高于西药组（P均＜0.01）。见表7、图1、表8、图2。

表7 MKN45组织中ERK2、ETS1、MMP9蛋白的相对表达量（±s）

表7 MKN45组织中ERK2、ETS1、MMP9蛋白的相对表达量（±s）

与空白组比较▲P＜0.01；与西药组比较△P＜0.01。

组别 n中药组 8西药组 9空白组 8 ERK2 ETS1 MMP9 0.82±0.1▲△0.70±0.06▲△0.82±0.07▲△0.5±0.02▲0.42±0.03▲0.48±0.07▲1 1 1

图1 MKN45组织中ETS1、ERK2、MMP9蛋白的表达

表8 BCG823组织中ERK2、ETS1、MMP9蛋白的相对表达量（±s）

表8 BCG823组织中ERK2、ETS1、MMP9蛋白的相对表达量（±s）

与空白组比较▲P＜0.01；与西药组比较△P＜0.01。

组别 n中药组9西药组9空白组9 ERK2 ETS1 MMP9 0.86±0.06▲△0.67±0.04▲△0.63±0.05▲△0.40±0.04▲ 0.39±0.04▲ 0.44±0.03▲1 1 1

图2 BCG823组织中ETS1、ERK2、MMP9蛋白的表达

3 讨论

脾胃为生痰之源，脾胃系统疾病大多导致痰湿内停的病理改变。有文献[6]提出痰与胃癌发生有内在联系，治疗应从痰着手。在胃肠道肿瘤的治疗中，化痰散结类中药应用较多[7]，还有文献[8]提出痰浊的产生可以促进胃癌的复发与转移。可见“痰湿阻滞”与胃癌的发生和转移有紧密联系。

“六腑以通为用，以降为顺”，胃为六腑之一。《素问·五脏别论》谓“六腑者，传化物而不藏，故实而不能满也”，强调六腑通降才能发挥正常功能，而通降失常将导致多种疾病。该理论在临床中用于指导多种疾病的治疗，特别是脾胃系统疾病中应用较广。前人根据该理论指导胃溃疡、胃炎、胰腺炎、大肠癌等疾病的治疗[9]。在胃癌的治疗方面，相关研究[10-11]提出以通降腑气法治疗胃癌，取得较好疗效。可见“腑气不通”也是胃癌发病的病机之一。

本文基于“胃癌痰污染”[12]理论及“消痰散结方”[13]的临床与实验研究，提出“痰浊阻滞，腑气不通”是胃癌的核心病机，并拟定“涤痰荡瘤汤”治疗胃癌。该方中半夏、天南星二味燥湿化痰，消痞散结，共为君药，临床广泛用于胃肠道肿瘤的防治[7]。牡蛎、海螵蛸、浙贝、瓜蒌、大黄此五味药为臣药。牡蛎、海螵蛸、浙贝化痰软坚，常被用于胃肠道肿瘤防治[7]。瓜蒌宽胸散结、清热涤痰、润燥滑肠，有抗胃癌、宫颈癌等作用[14]。大黄泻下攻积、逐瘀通经，有较好的抗肿瘤效果[15]。全蝎、地龙、守宫此三味助君药以通络散结消肿，共为佐药，具有很好的抗癌作用[16-18]。诸药合用共奏化痰散结，通腑降气之功，充分体现胃癌“痰浊阻滞，腑气不通”病机特点。此外，治疗胃癌应强调“寒热平调”思想。课题组认为胃癌产生多因情志不遂、饮食不节或感受外邪所致，这些病理因素本身有寒有热，发病初期邪盛为主，久病邪气伤正加之失治、误治损伤脾胃肝胆，形成正邪相恋、寒热错杂的状态。有学者[19]研究胃癌前病变也发现寒热错杂是其病机特点，从疾病发展演变的角度间接论证了胃癌的寒热错杂属性。“涤痰荡瘤汤”治方充分体现寒热共用特点，方中半夏、天南星、海螵蛸三者药性属温，用量大而药味少；瓜蒌、大黄、浙贝、地龙、守宫五者药性偏寒，用量小而药味多；全蝎性平，诸药合用体现寒热平调思想，此为该方的治方特点之一。

microRNA是19～23个核苷酸组成的一类小分子非编码RNA，通过与靶基因信使RNA3'非翻译区结合而抑制靶基因蛋白翻译，发挥转录后基因调控的作用。许多microRNA通过调节特定靶基因表达参与胃癌的形成和进展[20-21]，有研究[22-23]显示，热疗可通过上调miR-218抑制胃癌细胞迁移及提高胃癌细胞对顺铂的敏感性，这与张仲景“病痰饮者，当以温药和之”的理论相吻合。可见，microRNA不仅可作为胃癌诊断的标志物，还可作为抗癌治疗靶点及治疗反应的预测标志物，本课题以microRNA-506-3P及ERK2/ETS1/MMP9通路为靶点探索中药的作用机理。有研究[5]显示，microRNA-506-3p可通过介导ERK2/ETS1/MMP9通路而调节胃癌的增殖和转移。MicroRNA-506-3P能抑制胃癌细胞增殖，对胃癌诊断、防治有重要意义[24]。ERK2及ETS1的mRNA的3＇UTR区均存在microRNA-506-3p的结合位点，提示microRNA-506-3p能作用于ERK2/ETS1信号轴。在胃癌进展过程中ERK2/ETS1信号轴可促进血管生成和肿瘤侵袭[25]。MMP9可诱导细胞外基质降解而引起肿瘤转移[26]，其编码基因的启动子区存在ETS1结合位点，提示ETS1可调控MMP9的表达。可见ERK2/ETS1/MMP9相关信号通路在肿瘤侵袭过程中有重要调控作用。

本课题组提出“痰浊阻滞，腑气不通”是胃癌发生和发展的关键病机，而microRNA-506-3p可调控ERK2/ETS1/MMP9通路而调节胃癌进展，并假设“痰浊阻滞，腑气不通”与microRNA-506-3p及ERK2/ETS1/MMP9信号通路有内在联系。基于此，本课题从microRNA-506-3p及ERK2/ETS1/MMP9通路探索涤痰荡瘤汤的抗癌机理。结果显示，在MKE45和BCG823两种移植瘤中涤痰荡瘤汤都能提高胃癌组织中microRNA-506-3p表达量，降低ERK2和ETS1的基因及蛋白表达量。关于MMP9在基因和蛋白表达方面有所不同。在MKN45移植瘤中，三组基因表达差异均无统计学意义；而在蛋白表达方面，涤痰荡瘤汤和5-FU都能减低MMP9表达，造成这种差异的原因可能是mRNA与蛋白质的半衰期不同。mRNA比蛋白质容易降解，在组织中存在时间较短，造成同一时间基因和蛋白表达的不一致。考虑到蛋白质才是生命活动的执行者，本实验对结果的解释以蛋白表达为准。研究结果还显示，在肿瘤抑制方面，中药抑瘤率较西药低，但从动物一般情况及体质量来看，中药能明显改善荷廇鼠的生存质量，体现中药副作用小的优势，值得深入发掘研究。综上所述，涤痰荡瘤汤能有效抑制胃癌增殖和转移，其机理可能与提高microRNA-506-3p表达进而调控ERK2/ETS1/MMP9通路相关。MicroRNA与靶基因的对应往往是相互一对多的关系，即一个microRNA调控多个靶基因，一个靶基因也可能受多个microRNA调控。因此，仅通过控制一种microRNA的表达来研究靶基因调控是远远不够的，本方是否通过其他microRNA和通路起效有待进一步研究。