种子休眠与解除的分子机制研究进展

吴 玉， 周亚晶， 胡 惠， 沈永宝,2

(1.南京林业大学林学院， 江苏 南京 210037；2.南方现代林业协同创新中心，国家林业和草原局南方林木种子检验中心， 江苏 南京 210037)

种子休眠与解除一直是种子生理学和种子生态学的研究热点。种子休眠是一种自然现象，是指在特定时间范围内，在适宜条件下，具备萌发能力的种子无法发芽的现象。种子休眠是植物适应性的重要组成部分，可以避免种子在不适宜的时期或者季节萌发而带来一定的损失。但是种子休眠也为农林业生产带来诸多的不便，例如在育种或者造林等领域，种子休眠现象成为了阻碍[1]。为更好了解种子休眠与解除机制，需要从分子角度来分析种子休眠和解除过程中涉及的各种调控因子、环境因素的影响以及种子休眠的保护机制，对利用和解除种子的休眠具有重要意义。

1 种子休眠

种子休眠由不同调控因子所控制，这些调控因子在不同的水平上起作用，并且表现出不同程度的特异性。这些调节因子主要涉及种子成熟、激素作用、休眠和染色质调节等四个方面[2]。

1.1 种子成熟调节

种子休眠是在种子成熟过程中，积累物质逐渐增多且含水量逐步降低，种子脱水耐受性提高，内部的代谢活动逐渐停止，种子停止萌发。在种子成熟及胚长成幼苗的过程中，ABSCISIC ACID INSENSITIVE 3(ABI 3)、LEC 2、LEAFY COTYLEDON 1(LEC 1)和FUSCA 3(FUS 3)这4种转录因子起着重要的协同和调控作用，如果有一类产生突变，将打破种子的正常成熟过程，使种子发育异常，最终导致种子的异质性表型[3]。最近研究表明，种子休眠相关转录因子在某些植物基因(ABI3、FUS3、LEC1和LEC2等)中可以调节，通过调节可以使得休眠转录因子发生改变。例如，玉米VIVIPAROUS8(VP8)被证实能对转录因子进行调节，该基因如果出现突变，最终将导致胎生种子发育进程发生改变。另外水稻同源物PLASTOCHRON3/GOLIATH(PLA3/GO)和拟南芥同源物ALTEREDMERISTEMPROGRAM1(AMP1)的突变体表现出休眠水平的改变，该发现表明，双子叶和单子叶这两种植物内部有某种机制存在。植物中的谷氨酸羧肽酶被这些同源基因编码，可能与种子的成熟和休眠相关[4]。

1.2 激素调节

种子休眠受到植物激素调控，植物激素可以通过信号转导对种子内各种生理变化做出反应，调节相关酶和蛋白质代谢，进而调控种子休眠和萌发。1971年，Khan根据已有的研究状况提出了三因子调节假说，即萌发促进物质赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)和萌发抑制物质脱落酸(ABA)之间的相互作用决定着种子的休眠与萌发，不同激素状况对应不同生理状态。能萌发的种子中均存在生理活性浓度的GA，但是存在生理活性浓度的GA的种子不一定能萌发，如果同时存在GA和ABA，则GA诱导萌发的作用就会受到抑制，而GA、ABA、CTK同时存在，则CTK能起到解除这种抑制作用而使萌发成为可能。因此，GA是种子萌发的主要调节因子，而CTK仅在ABA存在时才是必需的。

ABA参与调控植物生长发育的各个阶段，是植物最为重要的激素之一[5]。在许多植物中，ABA涉及种子休眠的诱导与维持。ABA可以阻止种子萌发，其积累量与种子休眠的发生有关。ABA合成基因表达能增加种子中ABA含量,从而促进种子休眠或延迟萌发；相反,种子发育过程中ABA含量不足与成熟种子初生休眠的缺乏有关。ABA 是由类胡萝卜素合成的，9-顺式-环氧类胡萝卜素氧化裂解为黄氧素(xanthoxin)是ABA生物合成的关键调控步骤。核心ABA 信号传递组分主要由 PYR/PYL/RCAR(pyrabactin resistance 1/pyrabactin resistance 1-like/regulatory components of ABA receptor)蛋白、A组2 C类蛋白磷酸酶(group A type 2 C protein phosphatase，PP 2 C)、亚类Ⅲ蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶2(subclassⅢ sucrose nonfermenting-1-related protein kinase 2，SnRK 2)和 ABF(ABA-responsive element (ABRE)-binding factor)/AREB(ABRE-binding protein)转录因子组成。近期关于ABA的一个重要发现是PYR/PYL/RCAR-ABA受体的鉴定。拟南芥中该蛋白家族的14个成员通过与2 C型蛋白磷酸酶(PP 2 C)负性调节剂之间的拮抗作用来介导ABA响应中的冗余作用。但是，目前尚不清楚这些PYR/PYL/RCAR蛋白是否在种子成熟阶段特异参与ABA信号传导。PP 2 Cs ABA-INSENSITITVE 1(ABI 1)和ABI 2最初是在ABA不敏感的突变体筛选中鉴定的。abi1-1和abi2-1突变体表现出降低的休眠表型，是由显性负突变导致abi蛋白不能与ABA受体结合引起的。因此，在ABA存在的情况下，这些abi-PP 2 Cs保持活性并抑制属于SNF 1相关蛋白激酶亚家族2(SnRK 2)下游ABA激活的蛋白激酶。在拟南芥种子发育和休眠诱导的过程中，SnRK 2(SnRK 2.2，SnRK 2.3和SnRK 2.6)在ABA信号的传递中起着冗余作用。这些激酶的三重突变体对ABA几乎不可见，表现为种子发育异常，产生类似于abi3等位基因的ABA不敏感绿色种子，并在高湿度条件下提前萌发。这些激酶的主要靶点是一组bZIP型转录因子，包括ABI 5和ABSCISICACID响应元件结合蛋白3(AREB 3)。这些转录因子的突变体通常没有表现出强烈的休眠表型，这可能是因为它们的冗余功能，但也可能有其他重要的靶点在休眠诱导过程中充当ABA反应的调控因子[6]。

与ABA作用相反，GA对种子的萌发具有促进作用。GA可以通过刺激诱导水解酶,削弱屏障组织(如胚乳或种皮)，诱导种子中贮藏物质的储备，刺激胚的生长，以促进萌发。还可以部分通过染色质重塑因子PICKLE(PKL)介导，刺激胚发育期向营养生长期的转变，进而促进种子萌发。番茄和拟南芥的生理生化和遗传研究表明，种子萌发时GA对种胚外围结构起弱化作用。这种弱化作用是萌发的先决条件，是由GA诱导的几种细胞壁水解酶共同作用完成的。吸收和萌发过程中的环境信号(光和温度)，通过光敏色素相互作用因子3-LIKE 5(PIL 5)和SPATULA(SPT)因子等整合到GA生物合成和信号传导中。GA的积累与休眠释放或种子萌发相关，但对完全休眠的拟南芥种子单独使用GA处理却不能促进萌发。这说明GA可能是种子萌发的必要条件,但不是充分条件。

另有研究证实,乙烯ETH与ABA的信号转导相互作用可以促进种子休眠的释放。ETH可以调节独行菜胚乳帽的弱化和破裂,进而抵消ABA的影响。乙烯era3突变体对ABA具有高敏感性，乙烯etr1和ein2突变体被认为是对abil突变体分别起增强和抑制作用，其他乙烯不敏感突变体也显示出对ABA反应的加强。这些研究表明，休眠程度的提高与种子萌发过程中对ABA敏感度的提高和ABA合成量的增多有关。相反，ctr1突变体以及用乙烯生物合成中间体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)单独处理野生型种子都可以降低对ABA的敏感度。因此，乙烯对种子萌发的促进作用可能是通过对ABA信号转导的拮抗作用进行的。

最近的研究表明，独脚金内酯和karrikins(烟雾中的促发芽化合物)在休眠和发芽中起作用。独脚金内酯信号由多腋枝2(MAX2)等位基因的F盒蛋白KARRIKININSENSITIVE 1(KAI 1)传导。kai1/max2突变体显示初级休眠增加。独脚金内酯调节次生休眠控制中的ABA/GA比值。这些研究结果强调了不同激素协同作用在调节休眠和萌发中的重要性[7]。

1.3 种子休眠的特异基因

研究发现，当前已经确定一些基因可以对种子休眠进行调节，这些可以起到调节作用的特异基因，使得种子表现出一种特异生长模式。主要代表基因是延迟萌发DOG1[8]和减少休眠RDO5。在拟南芥休眠基因突变过程中，以上两个基因发挥重要作用，目前已经被确定为数量性状位点。DOG1参与了拟南芥种子成熟期间低温促进休眠的过程，某种蛋白质由该基因编码，目前该蛋白质的功能未知。研究发现，dog1突变体多效性表型不明显，由此可以确定DOG1对种子休眠有重要联系，是关键的调节因子(图1)[9]。RDO 5是种子中的一种伪磷酸酶，对种子磷酸化蛋白质组织会产生重要影响[10]。研究发现，种子休眠水平和RDO 5与DOG 1两种蛋白的含量密切相关，但与ABA无关。ABA和DOG 1都是诱导种子休眠的必需因素，表明它们的信号传导途径在关键的下游步骤汇聚。DOG 1蛋白的数量在种子贮藏期间是稳定的，即使种子吸胀后，该蛋白仍然存在，以上现象说明这种蛋白质在种子贮藏过程中已经丧失活性[11]。另一个基因是MFT，它编码植物磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族的成员。MFT调节拟南芥和小麦的萌发，其功能尚未阐明，但在ABA信号传导过程中，起到负反馈调节的作用。当前一些学者通过对作物休眠相关的数量性状基因座进行克隆，结果发现了更多的种子休眠调节因子。部分调节因子具有种子特异性，例如大麦中的丙氨酸转氨酶(AlaAT)[12]和水稻中的种子休眠4(Sdr 4)[13]。其他更为普遍表达的因子，如在大麦和小麦中鉴定出的丝裂原活化蛋白激酶(MKK 3)。尽管Sdr 4被证明影响DOG1水稻同源基因表达水平，尚不了解这些基因和种子的休眠途径之间存在何种联系[14]。

1.4 染色质水平上的休眠调节

基因表达过程中会受到染色质影响，而这最终将影响植物的发育和成长，种子休眠和萌发也会受到影响。不过研究发现，染色质因子发生突变后，植物生长过程不是都会受到影响。研究表明，在成熟期间，种子休眠诱导和减小核大小、染色质的紧实是相互独立的[15]。目前，遗传和生化研究已经确定了许多调节种子休眠和萌发所需的染色质因子。减少的休眠4(RDO 4)/组蛋白单泛素化1(HUB 1)及C 3 HC 4环指蛋白。RDO4/HUB1基因最初是基于其降低的休眠表型而鉴定的。 在突变筛选过程中发现，RDO2基因可减少种子休眠，该基因也是延长因子SII(TFIIS)[16]。据预测，HUB和RDO 2蛋白可与RNA聚合酶II相关因子1复合物(PAF 1 C)相互作用，并通过调节种子成熟过程中的转录延长来影响种子休眠，而此时干燥效率则可能会降低转录效率。另外，PAF 1 C其他组分的突变体也显示出休眠性降低，在这些突变体中，DOG1和ABA相关基因受到一定的调控，这是与其休眠表型降低的潜在原因。在转录网络建模研究中，在一项转录网络模型研究中，选择了短日早花基因(EFS)作为种子萌发过程中的相变调控因子。EFS编码组蛋白H 3甲基转移酶，参与组蛋白H 3赖氨酸4修剪乙基化(H 3 K 4 me 3)，这是一个转录激活组蛋白标记。通过改变开花时间初步鉴定了efs突变体。突变的efs种子表现出多种种子表型，包括早熟萌发。与休眠相关的EFS的直接靶点还没有被发现，但一个潜在的靶点是开花位点C(FLC)，因为它的表达在开花时间的控制中受到EFS的调控，并且与萌发调控有关[17]。抑制性组蛋白标记H 3 K 27 me 3参与休眠诱导的证据来自于对受精-非受精胚乳(FIE)的空突变体的研究，FIE是多梳抑制复合物2(PRC 2)的重要组成部分。fie突变体在H 3 K 27三甲基化过程中存在全局性缺陷，由于其比野生型更具休眠性，缺乏这种组蛋白修饰会导致种子休眠的增加[18]。微阵列分析表明，许多成熟调节因子，即ABI 3、FUS 3、LEC 2以及ABA/GA信号因子和DOG 1被PRC 2抑制。最后抑制性组蛋白标记H 3 K 9 me影响种子休眠[19]。氪石(KYP)/SUVH 4和SUVH 5基因编码介导H 3 K 9二甲基化的组蛋白甲基转移酶。kyp-2和suvh5突变体显示出增强的休眠性并增加了包括DOG1和ABI3在内的多个休眠基因的表达。由于ABA下调了KYP/SUVH4的表达，而GA上调了KYP/SUVH4的表达，因此KYP/SUVH4可能至少部分介导了ABA/GA平衡对种子休眠的下游信号传导[20]。

2 种子休眠解除

休眠可以在吸收的种子中快速解除(几天之内)，或者在干燥的种子中相对缓慢地解除(几周或几个月内)。与控制休眠诱导的分子机制相比，对控制休眠解除的分子机制了解得较少。在特定温度下，种子休眠快速解除需要进行吸胀，通常称之为层积。低温吸胀使夏季一年生种子休眠解除，而高温吸胀则使冬季一年生种子休眠解除[21]。目前尚不清楚层积如何驱动种子休眠的解除，特别是温度感测机制尚不清楚，但已鉴定出一些在此过程中起作用的基因[22]。基本的螺旋-环-螺旋转录因子SPT和PIL 5在冷层积中起重要作用。SPT是发芽的负调节剂，在层积后会失去其抑制活性，而PIL 5对低温没有反应，但经过冷处理后在黑暗中会抑制发芽。两种转录因子均通过抑制GA生物合成基因GA3氧化酶1(GA3OX 1)和GA3OX 2的表达起作用，从而阻止了发芽(图1)[23]。休眠可以通过去除(划痕)萌发的限制(即胚胎周围的组织)，或在在干燥条件下(后熟)于室温下保存种子来进行人工解除休眠。后熟时间的增加与发芽所需条件的扩大有关，类似于休眠的逐渐丧失。完全解除休眠所需的时间显示出物种间的高度差异。例如，在拟南芥中，Landsberg erecta(Ler)和Cape Verde Islands(Cvi)对后熟的要求有很大不同。Ler需要12～17 d的干贮藏来达到50%的发芽率，而Cvi需要74～185 d[24]。后熟在低水分含量(MC)为5%～15%时有效，目前还不清楚种子在后熟过程中发生的变化是否主要发生在转录或蛋白质水平，但最近的研究结果已经开始揭示这个问题。一些转录组分析表明，后熟会影响干种子中转录本的丰度，导致特定转录本的选择性变化[25]。种子干贮藏过程中转录物丰度的增加似乎是反常的，但可以用烟草干种子中出现的“湿袋”现象解释。种子中水分含量较高的此类局部区域可能允许转录活动，显示了干烟草种子中β-1，3-葡聚糖酶的瞬时转录和翻译变化[26]。然而，干种子中活性转录的存在还有待证实。另外，干种子中储存的mRNAs的数量和质量也可能通过不需要活性代谢的机制发生变化，最近的一项研究表明，向日葵种子解除休眠会受到mRNAs子集选择性氧化影响。在种子吸胀的过程中，mRNAs氧化将使得翻译受到阻碍，相应的蛋白质组织也会因此改变。而mRNAs的选择性氧化似乎与参与应激反应的基因相对应[27]。

干种子中的氧化过程也会影响蛋白质。蛋白质组学方法已被用作研究种子成熟后翻译过程中的翻译后修饰(PTM)动力学的工具。在种子发育和成熟期间，PTMs起到重要的调控作用。羰基化是一种不可逆的PTM，在氧化应激下发生，由于对蛋白水解酶攻击更敏感，导致蛋白质的酶和结合特性发生变化或降解[28]。后熟会导致活性氧的积累(ROS)，这与向日葵和拟南芥中特定蛋白质羰基化存在密切联系。种子贮藏蛋白特异性羰基化通过促进其蛋白水解作用，有助于种子在萌发过程中的动员。羰基化在哺乳动物中主要与衰老和疾病有关，而拟南芥种子在积累羰基化蛋白质时仍会萌发并长成健康的植株。研究进一步证实了ROS在小麦休眠解除中的重要作用，表明其抗氧化防御途径与维持休眠有关。氰化氢(HCN)是一种用于人工解除休眠的化合物，其信号转导具有ROS依赖性，并导致乙烯信号转导相关基因的表达增强，这一发现突显了ROS依赖途径在后熟过程中的重要性[29]。此外，Müller等[30]研究发现，产生NADPH氧化酶的ROS促进了拟南芥种子的后熟。DELLA阻遏蛋白是GA信号转导的负调控因子，被GA降解后抑制ROS的积累，从而增强了对非生物和生物胁迫的耐受性。尽管这种机制尚未在种子中得到证实，但它为GA通过间接增加ROS加速后熟化提供了可能性。

如前所述，ABA和GA在种子的休眠和萌发中起着重要作用。休眠和非休眠种子在这两种激素的水平和敏感性上的差异可能是在休眠解除机制的下游建立的。在拟南芥中的最新发现强调了胚乳在休眠解除中的重要性。ABA抑制了吸收过程中胚的萌发，而ABA是由休眠的胚乳主动产生并解除的。在许多物种中，普遍存在的一氧化氮(NO)信号分子解除种子休眠，被认为是一种内源性休眠调节因子[31]。NO以吸胀的拟南芥种子的胚乳为主要靶点，在GA上游的信号通路中起作用，导致糊粉细胞空泡化，与贮藏复合物降解有关[32]。Holmanet等[33]研究发现，NO可能通过降低吸胀种子的ABA敏感性而起作用，NO通过N端规则途径实现这一点。此途径的两个组成部分蛋白溶解度6(PRT 6)和精氨酰tRNA、蛋白精氨酰转移酶(ATE)，被证明调节后熟和降低ABA敏感性，暗示了靶向蛋白水解在休眠解除中的作用。

种子休眠解除发生在后熟过程中，但是种子存储时间的延长和高氧化应激，会导致蛋白质和核酸逐渐分解，导致活力丧失。拟南芥基因DNA连接酶VI参与控制种子老化，该基因突变导致种子寿命缩短和萌发延迟。种子休眠和种子寿命之间的联系仍然是一个悬而未决的问题。非休眠拟南芥dog1突变体种子在干贮藏期间比野生型种子的寿命短，表明休眠与寿命呈正相关。然而，检测到的休眠和寿命的QTLs并不总是同时定位，表明这两个性状的自然变异受不同遗传机制的控制。这能不排除休眠和长寿在基本层面上有联系的可能性[34]。

3 环境对种子休眠的调控

新鲜收获的种子具有较高的休眠水平，该休眠水平在随后的种子贮藏过程中逐渐解除(所谓的后熟)。在休眠解除期间，适宜种子发芽的环境条件逐渐出现。在自然条件下储存在土壤中的种子会监控其环境以调节其休眠水平。例如，吸水种子在短时间暴露于低温(层积)或烟雾中的化合物后会失去休眠状态。种子成熟过程中，其休眠水平会受到温度和光照等条件的影响。温度是控制休眠的主要环境因素，它通过几种确定的休眠调节剂来控制ABA和GA含量以及DOG1基因的表达。Kendall[35]研究表明，C-重复结合因子(CBF)组的转录因子对于调节由种子成熟温度低引起的休眠是必要的，CBF似乎也在光介导的芽休眠诱导中发挥作用，尽管CBF是休眠所必需的，但它们的转录丰度在种子中并不受温度调节。CBF、DOG 1和ABA/GA代谢是介导种子成熟温度对休眠状态影响途径的主要成分。此外，光敏色素和开花位点C(FLC)在种子成熟温度的相互作用中起着重要作用[36]。小麦种子成熟过程中与低温响应有关的另一个基因是FT和TFL1(MFT)。MFT是小麦3号染色体收获前发芽QTL的候选基因[37]。

4 结论与展望

生物领域关于种子休眠诱导调控以及其分子机制相关研究取得了显著进展，揭示了决定种子休眠的激素途径以及这些途径之间的相互作用。此外，不直接属于激素途径的特异休眠调节因子发挥着更显著的作用，研究确定了特异休眠基因对与诱导种子休眠相关的染色质组织会产生影响。休眠的解除长期以来一直是个未知区域，但最近对非酶促过程(例如氧化)在后熟过程中的重要贡献的认识正在揭示该过程背后的机制。

过去十年里，很多学者从转录和代谢物水平等方面对种子休眠进行深入研究，不过还没有取得积极进展，不过对更好地理解种子休眠机制有很大帮助。 但是在层积过程中如何感测温度几乎是未知的，更重要的是休眠的真正分子特性还不清楚。既不了解影响休眠因素之间的相互作用和联系，也不知道休眠的分子性质是由许多不同因素的组合组成，还是存在于所有这些因素下游起作用的中心剂。可以将这种假想的中心剂或休眠分子命名为“dormagen”，类似于诱导开花的分子“florigen”[38]。

尽管上述问题的最终解决可能仍需时日，但研究进展迅速。主要休眠基因如DOG1和Sdr4编码的基因功能以及对MFT作用的理解很快将被揭示。在分子水平上阐明后熟过程将导致分子标记的发展，这些标记构成了种子休眠水平的可靠读数。系统方法在控制休眠机制中的作用愈加重要，Bassel等[39]研究建立了休眠和萌发期间全球转录相互作用的网络模型(Seednet)，这项工作证明了现有转录途径(调节细胞相转变和非生物胁迫)对种子休眠的可能进化适应，对此方向的进一步研究有望带来新的见解。此外，从现有的大规模数据集中提取信息的改进方法将导致新基因和新机制的鉴定。Bassel等[40]利用共同预测来计算功能基因相互作用网络(ScoPNet)，确定了种子萌发的新型调节因子。