超高效液相色谱-串联质谱法同时测定柑橘中6种农药残留

2021-06-22何家国周凤蓉易珊珊彭海燕蒋金芳覃明丽

农药科学与管理 2021年5期

何家国，杜鑫，周凤蓉，易珊珊，彭海燕，蒋金芳，覃明丽

(南充农产品质量监测检验中心，四川南充 637000)

柑橘富含大量维生素、糖分、有机酸、蛋白质、脂肪、食物纤维及矿物质等营养物质，具有很高的食用和药用价值[1]。四川省地处长江上游优质柑橘生产区，有130多个县市区均种植柑橘，形成了各具特色的优势产业区域[2-3]。柑橘病虫害种类繁多，主要病害有红蜘蛛、潜叶蛾、炭疽病、蚧壳虫、疮痂病、树脂病等，主要虫害有蚜虫类、粉虱类、蚧壳虫类、落叶蛾等，危害日趋严重[4-8]。吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、咪鲜胺、乐果、阿维菌素等6种农药混合使用是防治上述病虫害常用的有效杀菌剂、杀虫剂及杀螨剂[8-9]。

超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS /MS) 具有灵敏度高、定量准确及抗干扰能力强等优点，被用于检测多种复杂基质中吡虫啉[10-12]、啶虫脒[11-12 ]、多菌灵[13-15]、咪鲜胺[14-15]、乐果[16]、阿维菌素[17]等农药，已成为农药多残留分析的主导技术和未来发展的趋势，但尚未有UPLC-MS/MS同时检测柑橘中吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、咪鲜胺、乐果和阿维菌素等6种农药残留的分析报道。QuEChERS方法被广泛应用于净化基质提取液，具有操作简易、溶剂用量少、分析速度快等优点[18-19]。本研究将QuEChERS净化方法与UPLC-MS/MS技术相结合，建立了同时快速检测柑橘中上述6种农药残留的分析方法，优化了测定条件，实现了简便、快速、准确检测大批量柑橘样品。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂 Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪，ML802型分析天平，HS501型振荡摇床，3-18KS型高速冷冻离心机，Vortex Genius 3型旋涡混合器，N-EVAP112型氮吹仪，RE-2000A型旋转蒸发仪，JB3060食品调理机，Milli-Q型超纯水仪，15/50mL离心管，PTFE(0.22μm)针筒式微孔滤膜。

吡虫啉、啶虫脒、多菌灵、咪鲜胺、乐果和阿维菌素等6种农药标准品，浓度均为1 000mg/L。甲醇、乙腈、甲苯、甲酸、氨水、甲酸均为色谱纯。氯化钠为分析纯。QuEChERS试剂盒、石墨化碳黑氨基复合柱(ProElut Carbon/NH2， 500mg/500mg/6mL)及氨基固相萃取柱(SPE-NH2，500mg/6mL)。柑橘类水果样品(橙、柑、橘、柚、柠檬等)。

1.2 样品制备取有代表性的柑橘全果样品带皮切碎，采用四分法缩分后约1kg，放入料理机中，高速匀浆均质后装入洁净的塑料样品盒中，密封后于-20℃冰箱保存(使用前先解冻至室温)。

1.3 样品提取准确称取10g(精确到0.01g)匀浆后的柑橘样品于50mL离心管中，加入20.00mL乙腈和1颗陶瓷均质子，拧紧离心管盖，摇床高速振荡20min，加入3g氯化钠，涡旋1min，5 000r/min离心5min，取上清液待净化。

1.4 样品净化 SPE-NH2固相萃取法：准确吸取上清液5.00～250mL锥形瓶中，40℃水浴减压旋转蒸发浓缩至近干，加入4mL甲醇+二氯甲烷(5+95，V/V)溶解残余物，加入经4mL甲醇+二氯甲烷(5+95，V/V)预活化后的氨基小柱中，用6mL甲醇+二氯甲烷(5+95，V/V)分2次涮洗锥形瓶后过柱，用鸡心瓶收集全部洗脱液于30℃水浴中减压旋转蒸发至近干，准确加入2.50mL甲醇-水甲醇-水( 1:1，V/V)，涡旋混匀，过0.22μm滤膜后装样。

SPE- Carbon/NH2固相萃取法：准确移取5.00mL上清液加入经5mL乙腈-甲苯(3:1，V/V)预淋洗的石墨化碳黑氨基复合柱(ProElut Carbon/NH2)中，在柱上加50mL贮液器，用25mL乙腈-甲苯(3:1，V/V)洗脱农药，收集所有淋洗液于鸡心瓶中，在40℃水浴中旋转蒸发浓缩至近干，准确加入2.50mL甲醇-水( 1:1，V/V)溶解残留物，涡旋混匀后过0.22μm滤膜，待上机检测。

QuEChERS方法：吸取6mL上清液加到内含900mg MgSO4+150mg PSA或885mg MgSO4+150mg PSA+15mg GCB的15mL塑料离心管中，涡旋混匀2min，5 000r/min离心5min，准确吸取2.00mL上清液于5mL试管中，40℃水浴中氮气吹至近干，加入1.00mL甲醇-水( 1:1，V/V)，混匀后过0.22μm滤膜，待上机测定。

1.5 仪器检测条件

1.5.1 色谱条件 Waters XBridge C18色谱柱(100mm×3.0mm， 3.5μm)，柱温40℃，样品室温度16℃，进样体积1.00μL；流动相为含有体积分数为0.05%甲酸的甲醇(A)、体积分数为0.08%氨水和0.10%甲酸的水溶液(B)及乙腈(C)组成的混合溶液，按(表1)中的梯度洗脱程序分离目标物。

表1 UPLC流动相组成和梯度洗脱程序

1.5.2 质谱条件电喷雾离子源的毛细管电压为3.0kV，锥孔气和脱溶剂气都用高纯氮气，锥孔气流量为150L/h，脱溶剂气温度为550℃，其流量为1 000L/h，碰撞气用高纯氩气，其流量为0.12mL/min。采用电喷雾正离子模式(ESI+)和选择多反应监测(MRM)方式采集数据，质谱仪信号采集时间段为3.5～8.5min，并利用在线切换阀将其他时间段的液相色谱流动相切换到废液，从而减少仪器污染。

1.6 标准溶液的配制准确移取各农药标准品，用纯甲醇逐级稀释成浓度为10mg/L标准储备液，于-18℃储存(使用前放至室温)。先将筛选出的脐橙空白样品按前处理方法制成基质溶液，按比例准确加入一定体积的农药标准储备液，配制成不同浓度的标准工作液。

2 结果与分析

2.1 色谱-质谱条件优化先用甲醇-水(1:1，V:V)分别将6种农药储备液逐级稀释至0.5mg/L的单标。选取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)为流动相。在ESI+电离模式下，为提高6种农药的电喷雾离子化效率，采取向甲醇中加入少量甲酸，水相中加入少量氨水和甲酸。

采取质谱直接进样的方式来优化质谱条件，结合不同流动相体系对6种农药进行了全扫描，分析其响应信号强度，结合仪器“Intellistart”功能快速优化出的质谱参数(表2)。试验发现，在酸性条件下，阿维菌素的加合离子峰主要以[M+Na]+形式出现，可能是因为阿维菌素分子结构中的醚键及羰基上的氧更易与Na+结合的作用位点，整个流路体系中极少的Na+都会与之结合形成加钠峰，而其余5种农药的[M+H]+加和离子峰响应信号较强。

表2 6种农药在MRM模式下UPLC-MS/MS分析的质谱参数

采用色谱进样，观察目标物的保留时间、峰形、响应信号强度，优化后的流速及流动相梯度体系等条件(表1)，6种农药的标准溶液色谱图(图1)。结果表明，在优化后的色谱和质谱检测条件下，6种农药在10min内全部出峰，峰形及分离度很好，且都可获得较强的分子离子峰强度。采用甲醇-乙腈-水体系并加入少量氨水和甲酸后，确实有利于提高目标物的离子化效率，有效改善目标物峰形，增强目标物响应信号，提高方法选择性和灵敏度。

图1 6种农药的试剂标准溶液MRM色谱图

2.2 前处理方法的选择在农药多残留分析中，常以乙腈、乙酸乙酯、丙酮及二氯甲烷等有机溶剂为提取剂，其中乙腈对农药的溶解性最强，对试样中油脂和色素类杂质的溶解度较小。利用盐析法还可以除掉柑橘样品乙腈提取液中的糖类、色素、维生素、有机酸物及脂肪等大部分杂质，有利于下一步净化提取液中仍残留的各种干扰物质，减弱样品基质干扰，降低基质效应影响。试验以脐橙为基质，添加的农药含量为100.0μg/kg，分别考察了SPE-NH2、SPE-Carbon/NH2及以900mg MgSO4+150mg PSA或885mg MgSO4+150mg PSA+15mg GCB为分散剂的QuEChERS方法，分析加标样品中6种农药的加标回收率来考察净化效果(图2)。

图2 不同净化方法对目标物回收率的影响

研究表明：采用SPE-NH2和PSA净化时，6种农药的回收率相近，均在80%～105%，回收率良好。但使用Carbon/NH2和GCB净化后，6种农药的回收率均有所降低，且发现多菌灵回收率仅约为35%，明显低于其它两种方法，这是因为GCB对具有平面结构的农药具有很强的亲和力[18]，导致具有类似结构的多菌灵农药大部分被吸附在填料上，测定浓度减小，回收率降低。此外，通过比较SPE-NH2和PSA净化后的空白基质的色谱峰响应信号，发现PSA净化后的空白基质溶液的色谱图干扰峰更少，背景响应信号更低，可见用PSA净化样品更干净，于是选用900mg MgSO4+150mg PSA来净化样品，使得试样前处理效率更高，溶剂用量极少，橙基质空白及基质标准溶液的色谱图(图3～4)，表明净化后的脐橙空白基质不干扰样品中目标物的测定。

图3 橙基质空白MRM色谱图

图4 6种农药的橙空白基质标准溶液MRM色谱图

2.3 基质效应的影响基质效应是液质联用方法检测中普遍存在的现象，可能是因为电喷雾离子化效率易受样品基质的影响或色谱分离中的共流出物影响了待测成分的离子化效率，从而导致目标物响应信号的改变[15-19]。用甲醇-水(1:1，V/V)试剂溶液和不同柑橘基质溶液配制相同浓度的农药溶液，采用色谱进样来获得目标物的定量离子色谱峰面积，计算6种农药的基质效应的相对强度(ME)，ME=农药在基质中的定量离子对峰面积/农药在试剂中的定量离子对峰面积[20]，以ME对6种农药作图，考察不同柑橘样品基质的影响，结果(图5)。6种农药的ME值在1.01～1.27，说明6种农药在UPLC-MS/MS检测中有略微的基质增强效应。

图5 6种农药在4种柑橘基质中的ME

为提高准确性，实验采用反相高效液相色谱法分离目标化合物，减少共流出，减小基质干扰，同时采用基质匹配标准溶液校正方法对基质效应进行补偿。但是在批量检测过程中，由于柑橘样品种类众多，很难做到每一种样品均用基质匹配标准溶液绘制标准曲线。为此，对农药在春见、柚、橘和柠檬基质中的ME与脐橙基质的ME做了对比，(图6)可以看出，6种农药的ME值均在0.91～1.07，说明不同品种柑橘的基质效应差异较小，为使定量结果更准确，样品应统一采用基质匹配标准溶液绘制标准曲线来计算结果。

图6 春见、柚、橘和柠檬的ME/脐橙的ME

2.4 方法的线性范围和检出限用空白脐橙基质溶液配制6种农药的混合标准溶液，以每种农药的质量浓度(x，μg/L)为横坐标，定量离子对的色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，线性相关系数r均>0.997 9。用Masslynx V4.1软件计算信噪比(S/N)，以S/N=3计算得到方法的检出限为0.12～1.56μg/kg(表3)。

表3 多反应监测模式下6种农药的线性范围、线性相关系数和检出限

2.5 方法的回收率与精密度为模拟实样检测过程，准确称取10g均质好的空白春见、柚、脐橙和柠檬4种样品于50mL离心管中，每种农药分别添加5.00、10.0、100μg/kg 3个浓度水平，涡旋2min，密封过夜，待样品充分吸收农药后，次日按照1.2～1.6节条件进行样品前处理及上机检测，每个浓度水平做6个平行质控样品。以回收率(实际测定含量的平均值与参照值的百分比)表示准确度，以回收率的相对标准偏差(RSD)表示精密度，结果(表4)，6种农药在4种不同柑橘类水果中的加标回收率为76.3%～112.4%，RSD为2.1%～9.4%，均满足农药残留检测的要求[21]。

表4 方法添加回收率和精密度(n=6)

2.6 实样检测按本方法对30个柑橘样品进行检测分析，每个样品做平行双样，结果(表5)。6种农药在所有柑橘样品中均有检出，咪鲜胺检出率最高，乐果检出率最低；在有检出的样品中，咪鲜胺的平均含量最高，达到75.4μg/kg，其次是多菌灵64.8μg/kg、吡虫啉52.5μg/kg，啶虫脒37.1μg/kg，阿维菌素17.3μg/kg，乐果16.8μg/kg，检测结果与前期调查的部分柑橘基地使用农药的情况也相符合。