产后卵巢静止奶牛的血浆代谢特征

宋玉锡，张 锋，张 江，夏 成，张洪友，徐 闯

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆163319)

奶牛卵巢静止(inactive ovaries,IO)是指受到某些因素影响，导致奶牛的卵巢功能处于静止状态从而不能出现周期性的发情和排卵[1]。然而，近年来奶牛卵巢静止的定义中涵盖了卵泡直径小于8 mm，无黄体和囊肿的乏情奶牛[2]。目前，随着我国集约化牛场规模不断扩大和单产持续增高，奶牛产后卵巢静止所致的乏情发生率日趋升高。据报道，卵巢静止占奶牛乏情的26.3%，而在高产奶牛中高达40%以上[3]。因此，卵巢静止性乏情已成为现代奶牛业中高产奶牛产后亟待解决的主要繁殖障碍问题。

气相色谱与质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析是代谢组学中最标准化的方法且因其特定的优势被作为代谢组学的“黄金标准”分析技术[4]。由于奶牛产后代谢异常与卵泡发育和卵巢静止的发生密切相关，但有关奶牛产后卵巢静止与机体代谢的关系仍不十分明确。为此，本试验运用代谢组学的气相-飞行时间质谱联用(gas chromatography-time of flight mass spectrometry,GC-TOF-MS)技术以期获得卵巢静止奶牛与正常发情奶牛的血浆差异代谢物，探究其在奶牛产后卵巢静止发生中所起的作用，为今后奶牛产后卵巢静止发生机制的深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物本试验在黑龙江省某散栏式自由采食全混合日粮(TMR)的大型集约化奶牛场进行。随机选取产后45～60 d，年龄、胎次、体况相近的30头试验奶牛，通过直肠检查和B超检查卵巢及其卵泡大小，根据试验奶牛是否发情，排除其他疾病等因素的影响，分为卵巢静止组(IO，n=15)和发情组(E，n=15)。TMR日粮组成：精料8～9 kg、青贮17～20 kg、干草3.5～4.0 kg、脂肪300～400 g；TMR主要营养物质包括：干物质55.60%、粗蛋白16%、粗脂肪5.60%、钙180 g、磷116 g、中性洗涤纤维39.10%、酸性洗涤纤维20.30%、产奶净能7.33 MJ/DM。

1.2 血液样品采集试验奶牛于产后45～60 d清晨榨乳前空腹进行尾静脉采血，将10 mL血液置于抗凝管(含肝素钠)中，混匀后3 000×g离心10 min；将上清液(血浆)以12 000×g离心10 min，分装，-80℃保存待测。

1.3 GC-TOF-MS试验

1.3.1代谢物提取 每个样本各取50 μL置于EP管中，加入200 μL甲醇，再加入5 μL(溶于超纯水中1 g/L)L-2-氯苯丙氨酸，涡旋30 s混匀，-20℃静置10 min；将样本在4℃，12 000×g离心15 min；移取180 μL上清液于EP管中，取每个样本10 μL混合一起制成质控(quality control,QC)样本；将提取物置于真空浓缩器中进行干燥，干燥后加入30 μL甲氧胺盐酸盐试剂(溶于吡啶20 g/L)，轻轻晃动混匀，置于80℃烘箱中孵育30 min；每个样品加入40 μL BSTFA(含有1% TMCS)，再置于70℃烘箱中孵育1.5 h；室温冷却后，加入5 μL FAMEs(溶于氯仿)，随机顺序上机检测。

1.3.2上机检测 处理好的样品上机检测，使用Agilent 7890气相色谱系统与Pegasus HT飞行时间质谱仪结合进行GC-TOF-MS分析。该系统使用涂有5%二苯基的DB-5MS毛细管柱，5%二苯基与95%二甲基聚硅氧烷(柱长30 m，内径250 μm，膜厚0.25 μm；J&W Scientific，Folsom，CA，USA)交联。以不分流模式注射1 μL等分试样的分析物。使用氦气作为载气，前入口吹扫流量为3 mL/min，通过柱子的气体流量为1 mL/min。温度设置初始为50℃ 停留1 min，再以20℃/min的速率升至310℃，停留6 min。然后，注入温度280℃、传输线温度280℃和离子源温度250℃，电子轰击模式下的能量为-70 eV。在溶剂延迟4.70 min后，以全扫描模式获得质谱数据，m/z范围为50～500，速率为每秒12.5个光谱。

1.3.3数据处理 应用ChromaTOF软件对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析[5]。应用LECO-Fiehn Rtx5数据库进行质谱及保留时间指数匹配来定性物质。最后将QC样本中检出率50%以下或RSD>30%的峰去除。对原始数据进行处理以便于分析，首先基于四分位数距对偏移值过滤单个峰并去除噪音，保留单组或所有组中空值不多于50%的峰面积数据；以最小值二分之一的数值模拟方法填补原始数据中的缺失值，最后进行数据标准化和归一化处理[6]。

1.3.4统计分析与差异代谢物筛选 数据整理后，首先进行主成分分析(principal component analysis,PCA)。基于GC-MS的代谢组学数据的高维度和小样本特性，可能存在关联的无差异变量，无法进行更好的可视化和后续分析。所以进一步进行正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal signal correction partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)，以得到更可靠的代谢物组间差异与试验组相关程度的信息。

应用SIMCA软件对数据进行对数转换加UV格式化处理。首先，应用OPLS-DA方法建模分析，再用7折交叉验证模型质量。根据交叉验证的R2Y(模型对分类变量Y的可解释性)和Q2(模型的可预测性)评判模型的有效性；最后，通过置换检验200次(n=200)，随机改变分类变量Y的排列顺序得到不同的随机R2和Q2值，进一步检验模型有效性。

应用多元变量统计与单变量统计分析结合的方法可以从不同角度观察数据，避免假阳性错误或模型过拟合[7]。

本试验使用的阈值标准为t检验的P值小于0.05，同时OPLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)大于1。

1.3.5差异代谢通路分析 根据多元统计分析与单变量分析结果最终筛选出的组间差异代谢物，通过MBRole(www.csbg.cnb.csic.es /mbrole/)网站的ID转换获得差异代谢物在KEGG的ID，在KEGG数据库输入差异代谢物ID及上下调关系，搜索相关代谢通路，再用代谢物通路分析网站MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca)对差异代谢物进行代谢通路分析。

2 结果

2.1 代谢物总离子流图分析与代谢物鉴定QC样本的总离子流图(TIC)叠图(图1)显示，样本质谱峰的保留时间和相应强度重现性良好，说明整个检测过程中仪器稳定。

图1 所有QC样本TIC叠图

2.2 多元统计分析结果PCA得分图显示，样本基本处于95%置信区间内(图2)。由于两组间有重叠，需进一步进行OPLS-DA，结果显示，两组分开明显且基本都处于95%置信区间(图3A)。置换检验结果显示(图3B)，R2Y=0.82接近1，说明建立的模型符合样本数据的真实情况；而Q2的回归线与纵轴的截距小于零；随着置换保留度降低，Y变量比例增大，Q2逐渐下降；这表明原模型稳健性良好，不存在过拟合现象。

2.3 差异代谢物的筛选与鉴定应用单变量分析对代谢物进行统计分析，共筛选出16种血浆差异代谢物(表1)。其中，卵巢静止组相对于发情组升高的有9种，分别是葡萄糖2、葡萄糖6-磷酸、D-果糖-2,6-二磷酸、D-半乳糖酸、甲酰乙内脲、草氨酸、二氢羊毛甾醇、反油酸和α-生育酚；下降的有7种，分别是谷胱甘肽、L-焦谷氨酸、胸腺嘧啶脱氧核苷、3-羟基丙酸、单硬脂酸甘油酯、甘油酸、D-塔洛糖。

表1 发情组与卵巢静止组奶牛的血浆差异代谢物

2.4 差异代谢物通路分析通过筛选的差异代谢物KEGG的ID，确立了发情奶牛与卵巢静止奶牛血浆差异代谢物代谢通路分析图(图4)，分别为乙醛酸和二羧酸代谢(甘油酸)，β-丙氨酸代谢(3-羟基丙酸)，甘油脂代谢(D-半乳糖酸、甘油酸)，果糖和甘露糖代谢(葡萄糖2、D-果糖-2,6-二磷酸、葡萄糖6-磷酸)，丙酸代谢(3-羟基丙酸)，谷胱甘肽代谢(L-焦谷氨酸、谷胱甘肽)，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(甘油酸)，类固醇生物合成(二氢羊毛甾醇)和嘧啶代谢(胸腺嘧啶脱氧核苷)。其中，甘油脂代谢和谷胱甘肽代谢的颜色较深，圆形较大，所以相对影响较大。

注：图中横坐标表示排名第一的主成分得分；纵坐标表示第二的主成分的得分；散点表示样品

A.散点图，横坐标表示第一主成分的预测得分，纵坐标表示正交主成分得分;B.置换检验结果，横坐标表示置换保留度，纵坐标表示R2Y或Q2的取值，虚线表示回归线

注：气泡所在横坐标和气泡大小表示该通路在拓扑分析中的影响因子大小，越大影响因子越大；气泡所在纵坐标和气泡颜色表示富集分析的P值(取负自然对数，即-lnP-value)，颜色越深P值越小，富集程度越显著

3 讨论

本试验通过KEGG代谢通路对GC-MS筛选出的差异代谢物进行分析，构建了GC-MS网络代谢图谱(图5)。由于α-生育酚和胸腺嘧啶脱氧核苷酸与其他代谢物的关系不明，未列在网络代谢图中。

3.1 糖代谢与卵巢静止的关系葡萄糖可以参与包括糖酵解、糖异生、己糖胺途径和磷酸戊糖途径在内的多种代谢途径。本试验中IO奶牛血浆中葡萄糖2、葡萄糖-6-磷酸和D-果糖-2,6-二磷酸含量上升，说明IO奶牛的糖酵解或糖异生过程增强。这些糖中间代谢物的升高提示IO奶牛体内能量缺乏，糖代谢增强为机体供能，或满足机体泌乳合成乳糖所需。IO奶牛血浆中塔洛糖含量降低，D-半乳糖酸含量升高。塔洛糖是由纤维二糖2-差向异构酶催化半乳糖的酮-醛异构化生成[8]，在奶牛卵巢静止发生中的作用未见报道。D-半乳糖酸参与半乳糖代谢，是由半乳糖通过半乳糖氧化酶转化而来，可生成D甘油进入磷酸戊糖途径。D-半乳糖(D-gal)是一种简单的单糖，可以作为正常营养素在体内代谢，主要用于乳糖的合成[9]。乳腺中葡萄糖转换为半乳糖，半乳糖再与葡萄糖结合生成乳糖[9]。由此可见，IO奶牛产奶量高，机体乳糖合成需求增高，葡萄糖向半乳糖的转化增强，促进了半乳糖代谢，与本试验结果相符。

注：升高/降低是指卵巢静止奶牛

3.2 脂代谢与卵巢静止的关系甘油酸主要参与甘油脂代谢。甘油醛可以氧化生成甘油酸，然后在甘油脱氢酶作用下，生成甘油；也可磷酸化后生成甘油酸3磷酸，再参与糖异生或糖酵解途径。单硬脂酸甘油酯由长链脂肪酸与丙三醇酯化而来。甘油酯通常指由甘油和脂肪酸经酯化所生成的酯类，主要用于细胞内能量储存，与胆固醇酯细胞内脂滴一起形成作为热量储库[10]。因此，本试验中IO奶牛血浆中甘油酸和单硬脂酸甘油酯含量降低，表明甘油脂代谢减弱，甘油酯的合成减少，脂肪储备动员后用于合成乳脂和供能。反油酸是由油酸转化而来的，油酸以甘油酯的形式存在于动物脂肪中。本试验中IO奶牛血浆中反油酸含量的升高，表明机体脂肪动员增强，油酸甘油酯分解供能，从而导致反油酸增多。而脂肪动员增强后产生的高浓度游离脂肪酸会造成卵巢卵泡内的脂毒性，影响卵母细胞发育，降低奶牛的生育力[11]。二氢羊毛甾醇主要参与类固醇的生物合成，类固醇在雌性生殖中起着至关重要的作用，特别是参与排卵过程和牛的卵母卵丘复合体排卵前成熟[12-13]。由此可见，本试验中IO奶牛血浆中二氢羊毛甾醇含量升高，可能是由于类固醇合成受阻，性激素的合成受到障碍。

3.3 氨基酸代谢与卵巢静止的关系甲酰乙内脲参与精氨酸和脯氨酸代谢通路，是精氨酸参与尿素循环的中间代谢产物，主要用于合成肌氨酸。肌氨酸以磷酸肌酸形式储存在肌肉中，促进三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)合成[14]。本试验中IO奶牛血浆中甲酰乙内脲含量升高，表明尿素循环精氨酸分解增强，向磷酸肌酸的转化增强。3-羟基丙酸参与β-丙氨酸代谢。本试验中IO奶牛机体能量缺乏，因此体内的丙酮酸主要用于乙酰辅酶A的生成参与三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)供能，而减少向丙酰辅酶A的转化，且3-羟基丙酸向β-丙氨酸代谢增强，使得血浆中3-羟基丙酸含量降低，以便满足机体对能量的需要。草氨酸参与嘌呤代谢，是黄嘌呤的分解代谢产物，而草氨酸继续代谢为草酸和氨。草氨酸是丙酮酸的等排和等电子类似物[15]。而草氨酸生成的草酸可衍生为草酰胺并参与TCA循环。草氨酸的升高提示IO奶牛的嘌呤代谢与TCA循环可能增强。L-焦谷氨酸主要参与γ-谷氨酰循环和谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)代谢。L-焦谷氨酸可以由谷氨酰胺分子失去氨酰基形成，也可由谷氨酸环化转变而来[16]。γ-谷氨酰循环是六酶循环，是GSH合成和降解的主要途径[17]。GSH的抗氧化特性可以保护细胞免受自由基损伤[18]。氧化应激对生殖系统的不利影响涉及卵母细胞脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)，卵巢和子宫内膜的损伤，从而影响生育力[19]。因此，本试验中IO奶牛血浆中L-焦谷氨酸含量的降低，导致了谷氨酸含量也随之降低，随后导致其合成的GSH含量降低。这不利于卵母细胞的生长发育，可能是造成奶牛产后发生卵巢静止的因素之一。

3.4 其他代谢物与卵巢静止的关系维生素E是一种抗氧化剂，其水解产物为生育酚。维生素E的生物活性高度依赖于用于保留α-生育酚和排泄非α-生育酚形式的调节机制[20]。α-生育酚可作为过氧自由基清除剂来保护膜和脂蛋白中的多不饱和脂肪酸，还能促进雌性激素分泌，从而提高生育能力。维生素E不能通过自身合成，只能从食物中获取，由于两组试验奶牛的饲料相同，所以两组奶牛从食物摄取的维生素E含量应相差不大。然而，本试验中IO奶牛血浆中α-生育酚含量升高，提示其利用率降低。

胸腺嘧啶脱氧核苷酸主要参与嘧啶代谢，其合成需要谷氨酰胺与ATP。ATP是所有生物体中的一种通用能源，在生物过程中起着重要作用，包括膜离子通道泵的调节，DNA复制，生物合成和细胞代谢等[21]。本试验中在卵巢静止奶牛血浆中胸腺嘧啶脱氧核苷酸的减少，提示与机体谷氨酰胺或ATP不足，或DNA分解增强，可能与机体能量缺乏和氨基酸分解代谢增强有关，但与奶牛产后卵巢静止发生的关系尚不清楚。

本研究应用GC-TOF-MS技术，结合多元统计分析和单变量分析及生物信息学技术，获得了卵巢静止奶牛血浆中16种差异代谢物，其中卵巢静止组相对于发情组升高的有9种，下降的有7种。其主要参与糖代谢、甘油脂代谢、氨基酸代谢、类固醇生物合成和谷胱甘肽代谢等通路。这些差异代谢物为今后奶牛卵巢静止机制的研究提供了新的方向。