利用玉米秸秆栽培香菇的品质及重金属元素安全评价*

刘柱杉，徐 帅，孙晓仲，李 玉**，宋 冰

（1.吉林农业大学，食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118；2.吉林省质量检测研究院，吉林 长春 130118）

香菇[Lentinula edodes（Berk.）Pegler]属于担子菌门 （Basidiomycota） 蘑菇亚门 （Agaricomycotina） 蘑菇纲 （Agaricomycetes） 蘑菇亚纲 （Agaricomcetidae） 蘑菇目 （Agaricales） 类脐菇科 （Omphalotaceae） 微香菇属 （Lentinula）[1]。香菇在中国的栽培历史悠久，最早可以追溯到南宋时期吴三公的“砍花法”[2]。香菇子实体的蛋白质含量高于水果蔬菜，且与肉类相当，可以为人体提供优质的健康蛋白质，且含有多种人体必需的氨基酸。香菇子实体含有的饱和脂肪酸含量远远低于非饱和脂肪酸的含量，且脂质含量较低，属于天然的低卡路里食品[3]。另外香菇中麦角甾醇的含量丰富，麦角甾醇是维生素D的前体，可以在人体中促进钙吸收，有效预防人体佝偻病。香菇子实体中含有大量的维生素B12，是唯一含有金属元素的特殊维生素，人体不能合成。香菇含有的多糖和萜类物质可以增强人体免疫力，在临床中用于治疗肿瘤疾病[4]。因此，香菇逐渐成为一种重要的食药同源菌类产品[5]。

根据中国食用菌协会统计[6]，我国香菇产量从2010年的400万吨增长到2018年的1 000万吨，成为我国第一大食用菌栽培品种，香菇主要是利用椴木和木屑作为栽培基质进行栽培生产，但近年来，我国修订实施了森林资源利用的控制法规，香菇栽培基质的来源受到限制[7]。

通过香菇菌丝生长、利用农业废弃物中的木质纤维素材料获得高质量的副产品，非常适合作为绿色生态农业中的重要环节，这种栽培方法解决了香菇栽培基质的来源问题。在全世界范围内栽培基质替换是香菇栽培的研究重点，但基质对香菇子实体的营养成分影响还未知，缺乏利用不同农林废弃物种植秸秆的食品评价研究。Leifa等[8]在围绕热水预处理咖啡渣栽培香菇对其子实体营养特征的影响，发现使用热水预处理咖啡渣会增加香菇子实体中蛋白质含量；Li等调查了在不同基质中添加甘蔗渣对香菇子实体风味的影响[9-10]，发现基质中的碳氮比能够显著影响香菇生长。之前的研究中已证明不同配方间的玉米芯与玉米秸秆粉含量能影响香菇子实体质量构成和营养成分[11]，利用农业废弃物栽培香菇能够显著改善子实体营养特征。

香菇是药食同源的食用菌，在基质中添加玉米秸秆是否会改变子实体的营养性质从而增加其与传统栽培方式香菇的竞争力；玉米秸秆的混合添加是否会改变其子实体形态建成过程是迫切需要研究的问题。在玉米农业生产中除草剂、肥料等化学药剂的使用会使玉米秸秆富集有害金属元素，使用该类玉米秸秆栽培香菇的安全性评价同样需要深入探究。通过利用玉米秸秆与玉米芯混合添加栽培中国南方地区（浙江、福建和湖北等）的香菇菌株，探讨其广泛适应性并提出了更加高效科学的配方筛选数学模型，对香菇子实体质量构成及营养成分进行测定，用于评价玉米秸秆栽培香菇的重金属含量安全性，为玉米秸秆栽培香菇技术的广泛推广提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌株为香菇GW（吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，CCMJ2941）；玉米秸秆和玉米芯来自吉林农业大学玉米试验田；木屑由延吉德康生物有限公司提供。香菇菌株母种保存在PDA培养基中（新鲜马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨3 g、酵母浸粉2 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 000 mL）[12]，栽培菌种保存于由木屑78%、麦麸20%、石膏1%和石灰1%制成的菌包中（菌包重750 g，含水量55%）。试验中使用的聚乙烯内套袋（15 cm×55 cm×0.05 cm） 和聚丙烯外套袋（17 cm×55 cm×0.03 cm）由延吉德康生物有限公司提供。

1.2 仪器与设备

Spectra Max i3酶标仪，美国伯乐生物器材技术有限责任公司；KjeltecTM8000 FOSS Hilleroed凯式定氮仪，丹麦福斯有限责任公司；2050型FOSS Hilleroed自动脂肪分析仪，丹麦福斯有限责任公司；T6型可见分光光度计，中国北京普析通用仪器有限责任公司；7700×icp-ms型电感耦合等离子体质谱仪，美国安捷伦科技有限责任公司；日立L8900型氨基酸分析仪，日本日立有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 配方设计

配方模型设置遵循如下规则：0≤玉米芯+玉米秸秆粉≤50.00%，10.00%≤玉米芯≤40.00%，10.00%≤玉米秸秆粉≤40.00%，30.00%≤木屑≤60.00%，玉米芯+玉米秸秆粉+木屑为80.00%，麦麸为18.00%，石膏为1.00%，石灰+白糖为1.00%。灭菌后从各个配方中取500 g基质，在智能干燥箱中65℃烘干至样品恒重后测量基质碳氮比，碳氮比测量试验于吉林省质量检测研究院完成。使用单纯型格子法对混合秸秆配方进行设计，配方见表1。

表1 配方成分及碳氮比Tab.1 Cultivation materials of Lentinula edodes and C/N ratio

1.3.2 栽培方法及酶学活性调查

依照栽培配方表将特定比例的干燥原料与水混合，且保持含水量在55.00%～60.00%，pH自然。将湿重为2 000 g的基质装入聚乙烯菌袋后121℃度高压环境下灭菌3 h。根据中国农业部颁布的NY/T 1061-2006香菇等级标准[10]，采收开伞度小于6分的鲜香菇子实体（菌盖卷边的内边缘直径与菌盖直径的比值，开伞度以“分”表示，比值为1时，即菌盖平展时的开伞度为10分），记录产量并计算生物效率 （BE，%）[13]。

式中：W为收获香菇子实体后鲜菇的重量（g）；S为基质干物质重量（g）。

在香菇菌丝透壁后使用划线法测定菌丝生长速率，每12小时划线1次。菌丝满袋后取每24小时的菌丝平均生长速率 （GR，cm·d-1）[14]。

式中：L表示每24小时香菇菌丝生长的长度（cm）。

在菌丝满袋期（60 d），转色完成期间（90 d）和出菇期（100 d）测量羧甲基纤维素酶、漆酶和酸性木聚糖酶的酶活性。样品在液氮中快速冷冻并保存在-80℃下待测；测量酶活性时，基质在4℃下解冻，在冰浴中快速粉碎后于 6 000 r·min-1、4℃离心10 min，取上清液待测。根据蒽酮比色法测定纤维素酶活性，漆酶活性通过ABTS（2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）自由基增加速率法测定[15]，酸性木聚糖酶在酸性条件下会将木聚糖还原为单糖，DNS（3,5-二硝基水杨酸） 与单糖在水溶液中的显色反应可用于计算酸性木聚糖酶活性，3种酶的活性测定均使用商业测试试剂盒（中国苏州科铭生物科技有限公司）[16]。

1.3.3 干香菇营养成分检测

在50℃智能恒温培养箱内将采集到的新鲜子实体烘干至恒重，将其粉碎后于4℃保存待用。采用凯氏定氮法测定蛋白质含量[17]；采用索氏提取系统分析脂肪；总糖使用瓦特和美林法[18]。用电感耦合等离子体质谱仪测定香菇子实体中8种微量元素和4种有害金属元素含量[19]。用氨基酸分析仪于吉林省质量检验所分析了干燥子实体粉中的氨基酸组成。

1.4 数据统计与分析

采用 Miccrosoft Excel 2013和DPS 9.50进行数据处理与Duncan’s法单因素分析。每组试验重复3次，所得结果以（±s） 的形式表示。

2 结果与分析

2.1 不同配方间菌丝生长速率和产量的回归分析

不同配方香菇菌丝生长速率和产量回归分析结果见表2。

表2 菌丝生长速率和产量回归分析Tab.2 Model analysis on mycelial growth rate and yield

由表2所示，不同配方间菌丝生长速率的F值为3.18，说明模型显著。模型只有4.67%的几率是由误差造成的，R2=0.57，菌丝生长速率Y=0.28A+0.24B+0.33C+0.13AB+0.13A C－0.031BC。产量模型的 F值为8.54，模型只有0.12%的几率是由误差造成的，R2=0.78， 单 棒 重 y=474.44A+492.11B+476.66C －209.67AB+361.99AC－12.43BC。玉米秸秆粉与木屑的混合添加不利于菌丝生长速率和产量的形成因素，在产量结果中玉米芯在混合栽培料中的混合比例占主要比重时对产量影响小，玉米秸秆粉不利于产量形成。

在优化配方的参数设定内，把玉米芯（A）的目标值设定在10%～40%，玉米秸秆粉（B） 10%～40%，木屑（C） 30%～60%，菌丝生长速率的目标为0.28 cm·d－1～0.38 cm·d－1，单棒重目标设定最大值。模型筛选出的配方如下：配方Ⅰ：玉米芯25%、玉米秸秆粉10%、木屑45%（预测单棒重550.02 g，生长速率0.31 cm·d－1，准确度 92.40%）；配方Ⅱ：玉米芯 25%、玉米秸秆粉20%、木屑35%（预测单棒重478.90 g，生长速率 0.30 cm·d－1，准确度 47.50%）。基质中木屑含量与菌丝生长速率的关联系数最高且成正相关，配方的单型格子法筛选结果表明，过量的玉米秸秆粉不适宜混合在基质中栽培香菇，而玉米芯可以与木屑混合作为栽培香菇的基质主料。

2.2 混合基质对香菇子实体农艺形状的影响

通过比较不同配方的农艺性状，观察不同配方间香菇子实体形态特征以获得不同配方对子实体农艺性状的影响，探究一种或多种添加基质对子实体形态的影响[20]。各配方的农艺性状平均值为采集三潮菇后的平均统计数值。其中，一等菇的菌盖直径大于 5.5 cm，二等菇的菌盖直径大小为 4.5 cm～5.5 cm，三等菇菌盖直径小于4.5 cm。香菇菌株在不同混料配方中的农艺性状结果统计见表3及图1。

表3 香菇菌株在不同混料配方中的农艺性状Tab.3 Fruiting body traits of Lentinula edodes in different formulas

图1 香菇菌株在不同混料配方中的农艺性状Fig.1 Fruiting body traits of Lentinula edodes in different formulas

由表3及图1所示，不同配方香菇的生物学效率的大小顺序为配方3＜配方6＜配方4＜配方5＜配方1＜CK＜配方 2，配方 2的 C/N 较高 （46.27） 其生物学效率最高。配方4，配方5和配方6的生物效率差值为±1%，但是C/N的差值为±5%，C/N值较低的配方3生物学效率最低。配方2的生物学效率比CK组高6.22%，且在菌盖厚度、菌盖直径，菌柄长度、菌柄直径的数值最高。不同配方间仅在菌盖厚度上表现为差异显著。香菇不同混料配方的鲜菇等级面积和潮次柱状图见图2。

图2 不同配方对香菇子实体等级分布率的影响Fig.2 Effects of different formulas on the grade distribution of fruiting bodies

由图2所示，配方2的二等菇率最高（60%），配方5的一等菇率（38%）高于二等菇率和三等菇率。配方内的结果均表现为二等菇率最高，配方4和配方5的一等菇率大于三等菇率。

混合配方基质的不同添加量对产量生物学效率的影响显著。在单一考虑玉米芯，木屑和玉米秸秆粉作为基质栽培香菇菌株时，3种基质对产量影响小，而玉米芯与木屑混合添加的比例对生物学效率有增益作用。香菇是一种好氧的大型真菌[21]，菌包内的孔隙度也会影响菌丝生长，传统的木屑配方中含有80%粗木屑，使得菌包内的通气度高，而本试验中混料秸秆配方中混有颗粒度较小的玉米秸秆粉，降低了菌包内的孔隙度从而影响香菇的生长。Ma等[4]在使用特殊材料栽培食用菌时发现基质的低保水性会导致基质缝隙中含有过量水，水中的离子键限制了真菌生长过程中的物质合成，从而影响食用菌的生长。香菇混合栽培基质中玉米秸秆粉的低保水性同样影响了菌丝的生长发育，说明玉米秸秆粉不适合作为混料中的主料栽培香菇。

2.3 不同生长阶段的酶学活性分析

菌丝生长过程中会分泌漆酶，纤维素酶和木聚糖酶等用于降解基质来获得生长发育的营养。试验对香菇固态发酵过程中产生的漆酶，酸性木聚糖酶和羧甲基纤维素酶进行评价，其中菌丝分泌的漆酶主要分解基质中的木质素；酸性木聚糖酶主要分解基质中的木聚糖，酸性木聚糖酶的作用环境为pH 3.5～6.5，仅有少数在酸性条件下生长的真菌可分泌；羧甲基纤维素酶主要将基质中的纤维素分解成菌丝能够直接利用的寡糖[22]。不同时期香菇所分泌的酶活性统计见图3。

图3 不同时期酶活性Fig.3 Enzyme activity in different stages

图3结果表明，漆酶在3个时期（菌丝满袋期、转色完成期、出菇期） 的变化为满袋期漆酶活性最高，转色完成期活性最低，当处于出菇期时，漆酶活性上升却未达到满袋期水平，其中漆酶活性最高为配方3满袋期（11.07 U·g－1）。羧甲基纤维素酶活性表现与漆酶相似，配方4出菇期的羧甲基纤维素酶活性最高达到0.91 U·g－1。与漆酶和羧甲基纤维素酶相比，酸性木聚糖酶活性在香菇栽培过程不同时间段内，没有观察到与漆酶和羧甲基纤维素酶相似的变化趋势；在转色完成期的酸性木聚糖酶酶活性最低，配方1（12.75 U·g－1）、配方2（10.35 U·g－1）、CK（9.73 U·g－1）和配方5（11.50 U·g－1）在出菇期的活性最高，而配方3（14.64 U·g－1）在转色完成期的酶活性最高。

3种酶的酶活性结果表明，漆酶和羧甲基纤维素酶对香菇的出菇阶段最重要，菌丝分泌酶分解木屑和玉米秸秆中的木质素和纤维素促进生长[23]。在菌丝满袋时期内，大量的菌丝繁殖并聚集[24]，因此该期间漆酶和羧甲基纤维酶活性高。

在香菇菌丝转色过程中，菌丝体的活性较弱，说明菌丝体产生的酶只用于维持表面菌丝的生理结构变化[25－26]。出菇期间，为了获取子实体生殖生长过程所需营养，菌丝活动增强，酶活性同时增加。不同配方内的基质导致了菌包内纤维素、半纤维素等物质含量有所差异，造成不同配方内酶活性的差异。另一方面，木屑、玉米芯和玉米秸秆3种主料的物理特性使菌包内的孔隙度不同。酶活性受到pH、温度和氧气等因素的影响[27－28]，因此造成不同配方酶活力的差异。但是，为了完成香菇的整个生长周期[29]，定量的营养需要在基质中获取，因此尽管受到基质的物理、化学因素的影响，菌丝在满袋期、转色完成期、出菇期分泌漆酶和羧甲基纤维素酶的变化趋势相同，均表现为满袋期酶活性最高，转色完成期有所降低，出菇期酶活性虽上升但是低于满袋期这一高、低、高的变化趋势。

2.4 混合基质对鲜菇中矿物质及有害金属成分的影响

香菇可以通过固态发酵来富集多种矿物质元素[30－31]，混合秸秆栽培香菇是否会影响子实体内的矿物质元素和营养元素，是研究的主要重点之一。种植玉米时，化肥和除草剂等化学药剂会增加玉米秸秆中有害元素的含量，从而影响滑子蘑（Pholiota microspora） 子实体的元素和营养组成（氮和磷）[19]。不同配方子实体矿物质含量统计见表4。

表4 子实体矿物质含量Tab.4 Mineral composition of Lentinula edodes fruiting bodies

由表4所示，主要元素中配方3的钠元素（125.62 mg·kg－1）、镁元素（1 171.642 mg·kg－1）和钙元素（175.55 mg·kg－1）含量最高。传统配方与混合基质配方子实体微量元素没有显著差异。玉米秸秆粉含量最高的配方1的铜元素和锌元素含量最高，其中铜元素比CK组高37.29%；而配方2的硒元素含量最高达到 0.15 mg·kg－1。各配方香菇子实体有害元素的含量低于GB 2762－2017食品安全国家标准－食品中污染物限量中的标准。配方3的钙、钠、镁元素的平均含量比传统的木屑配方高20.00%。镁元素参与人体多种生命代谢，配方1中的镁元素远高于一般蔬菜（如豆角、西红柿和胡萝卜等）且与苏子叶镁元素含量相当 （1 140.00 mg·kg－1）[32－34]，是一种天然的镁库。除了在蔬菜中常见的铁、铜和锌元素，使用秸秆栽培香菇中检测到的硒元素也高于CK配方。大多数食用菌均可从基质中富集金属元素，香菇生长周期长因此其富集金属元素的能力比一般真菌强[35]。结果表明，使用混合秸秆基质栽培香菇不会使子实体的有害元素增加，香菇的高富集金属特性使其矿物元素较传统木屑配方有明显优势。

2.5 不同配方对鲜菇中营养元素及氨基酸含量的影响

不同配方对香菇子实体及氨基酸含量的影响见表5。

表5 子实体营养和氨基酸含量Tab.5 Nutritional and mineral composition of Lentinula edodes fruiting bodies

由表5可知，香菇子实体的脂肪含量低，但是粗蛋白和总糖含量高，香菇栽培基质碳元素、氮元素含量的不同会影响其子实体总糖和氨基酸含量[36]。研究表明，随着玉米秸秆比例的增加，滑子蘑生长过程中总氨基酸和必需氨基酸含量先增加后减少[18]。表5各配方总糖含量变化趋势为：配方4＞配方1＞CK＞配方2＞配方6＞配方3＞配方5。虽然CK配方的碳氮比适合香菇生长，但其碳元素、氮元素含量较低，使子实体营养成分低于其他配方。碳氮比较高的配方2在脂肪、总糖和粗蛋白含量依然有明显优势，碳含量最低的CK配方总糖含量为38.80%，比碳含量最高的配方4的总糖含量低9.15%。玉米芯含量最高的配方6粗蛋白含量最低。不同混合秸秆配方的氨基酸类型相同，但其丰富度不同。Pro和Phe的含量在各配方的差异不显著，配方4比其余配方高，在Arg、His、Lys、Tyr、Ala含量上均有优势。香菇子实体氨基酸中含有4种人体必需氨基酸，其中含量最高的是Val（1.18 g·100－1g－1）。

有研究表明在香菇栽培基质中碳和氮含量对子实体氨基酸含量有一定影响[11]。菌丝利用酶分解基质中的元素来合成氨基酸并未受到混合基质特性的影响，当基质作为营养库提供原料时，香菇仅摄取了必需的合成元素，从而使混合秸秆配方间的氨基酸含量并无明显差距。混合玉米秸秆配方生产的子实体与CK配方组相比保持了低脂肪和高蛋白质含量的优良特性，从而保持了混合配方的优势。

3 结论

农业、林业废弃物与菌丝固体发酵结合，不仅能高效处理废弃物，还能生产珍贵的可食用真菌，是绿色农业发展的必然趋势。香菇作为典型的木腐真菌，为其生产寻找更加绿色环保的木质纤维素基质为目前研究热点；为了评价子实体食用安全性；探究香菇生长过程中基质的木质纤维素降解规律；基质对香菇子实体质量的影响还需更深入研究。在香菇生长过程中，漆酶和羧甲基纤维素酶的活性在菌丝生长阶段最高，转色完成期下降，在出菇期又上升。玉米秸秆混合配方栽培香菇的优化比例为玉米芯25%、玉米秸秆粉10%、木屑45%，经过中试试验回归验证，该配方栽培香菇的实测产量529.71 g/棒，生长速率0.31 cm·d-1，准确度92.40%，适合在中国高温地区（浙江、福建和湖北等）推广。

过量的玉米秸秆粉不适宜栽培香菇，混合添加玉米秸秆粉不利于香菇产量的提高，玉米芯可以与木屑混合作为栽培香菇的基质主料并提高香菇的质量等级。混合秸秆配方所表现的优势主要有子实体总糖含量更高，有害金属元素未超标，子实体氨基酸含量丰富且基质中的含碳量和含氮量更高。