高效液相色谱法测定鸡肉中替米考星残留的前处理方法比较

张珍珍，杨卫军

(1.秦皇岛市农产品质量安全检验监测中心，河北 秦皇岛 066000 ；2.秦皇岛市动物疫病预防控制中心 , 河北 秦皇岛 066000)

替米考星(Tilmicosin，TIL)属于半合成大环内酯类抗生素，临床上主要用于治疗家畜肺炎、家禽支原体病以及泌乳动物乳房炎等。人类长期食用替米考星残留超标的动物源性食品，当体内蓄积的药物浓度达到一定量时会损害前庭和耳蜗神经，导致眩晕和听力减退，甚至可造成肝、肾的严重损害[1]，我国农业部第235号公告中规定替米考星在鸡肉中的最高残留限量不得超过75 μg/kg。

目前，鸡肉中替米考星残留的检测方法通常选用农业部1025号公告—10—2008《动物性食品中替米考星残留检测 高效液相色谱法》[2]，在日常检测中发现，由于鸡肉组织中基质复杂，富含脂肪和蛋白质，采用农业部1025号公告—10—2008方法对猪肉样品提取效果较好，而对鸡肉样品提取时，提取液容易呈浑浊状态，直接进入固相萃取柱，会出现柱子堵塞，净化效果不理想，在氮吹时由于脂肪的存在造成不易吹干、氮吹时间长等问题，从而导致目标化合物在前处理过程损失较多，回收率较低、不稳定，增大了残留检测的难度。因此，优化建立鸡肉组织中替米考星残留检测的最佳样品前处理方法，对检测结果的可靠性至关重要。

1 材料与方法

1.1 仪器 U3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)，Synergy Millipore超纯水器(法国默克密理博)，台式高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)，IKA MS3 digital数显旋涡混合器(德国艾卡)，ZD-85多用调速振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)，SPT-24V氮吹仪(北京斯珀特科技有限公司)，FW100高速万能粉粹机(天津泰斯特仪器有限公司)，XA205DU电子天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]。

1.2 试剂和耗材 替米考星标准品(纯度83.47%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)，磷酸二氢钾、二丁胺、磷酸、四氢呋喃、乙酸铵(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，甲醇、乙腈、正己烷(色谱纯，美国TEDIA公司)，Agilent Bond Elut C18固相萃取柱(6cc/500 mg，安捷伦科技有限公司)，3 mL一次性塑料滴管。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制 (1)标准储备液(200 μg/mL)：称取替米考星标准品约10 mg(按照标准品含量进行折算)，用乙腈溶解并定容至50 mL，置于4 ℃ 下避光保存。(2)标准中间液(20 μg/mL)：分别精密吸取标准储备液1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容，4 ℃下避光保存。(3)标准工作液：取20 μg/mL替米考星标准中间液于容量瓶中，用流动相稀释并定容，制成浓度为0.05、0.1、0.5、5.0 μg/mL和10.0 μg/mL的系列标准工作溶液，现用现配。(4)磷酸二氢钾缓冲溶液、洗脱液(0.1 mol/L 乙酸铵甲醇-乙腈，20+80，v/v)、流动相(乙腈-四氢呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸缓冲液，130+55+25，v/v/v)的配置参照农业部1025号公告—10—2008。

1.3.2 样品的前处理 方法1：农业部1025号公告—10—2008。方法2：参照农业部1025号公告—10—2008中前处理方法，并进行优化，具体操作如下。

(1)样品的提取:称取(2.5±0.05) g样品，置于50 mL具塞离心管中，加4.0 mL乙腈，涡旋混匀，中速振荡10 min，10 000 r/min离心5 min，上清液转入另一个50 mL离心管中。组织残渣中依次加2.5 mL磷酸二氢钾缓冲液和4.0 mL乙腈，涡旋混匀，中速振荡10 min，10 000 r/min离心5 min，合并2次上清液，加乙腈饱和的正己烷10 mL，涡旋混匀30 s，10 000 r/min离心3 min，用一次性塑料滴管吸去上层正己烷层，下层加25 mL水，涡旋混匀，作为样品提取液。

(2)样品的净化：将C18固相萃取柱置于固相萃取装置上，依次用6 mL甲醇和6 mL水活化；取样品提取液全部通过固相萃取柱，自然流干，再依次用6 mL 水和6 mL乙腈淋洗，挤干；用洗脱液5.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液；将洗脱液在50 ℃水浴中氮气吹干。用1.0 mL流动相溶解残渣，涡动30 s，放置10 min，期间涡旋混匀1次，经0.45 μm微孔滤膜过滤后作为试样溶液，待高效液相色谱仪测定。

1.3.3 色谱分离条件 色谱柱：C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-四氢呋喃-1 mol/L 二丁胺磷酸缓冲液(130+55+25，v/v/v)；流速：1.0 mL/min； 检测波长：290 nm；进样量：50 μL；柱温：30 ℃。

1.3.4 测定 分别取试样溶液和相应浓度的标准工作液，作单点校准，按外标法以色谱峰面积定量计算。

1.3.5 结果计算与表述 鸡肉组织中替米考星的含量X，以质量分数微克每千克(μg/kg)表示，按下式计算：

X=CSVA/AS/1 000m

式中：CS:标准溶液中替米考星的浓度，μg/mL；V:溶解试样残渣所用流动相体积，mL；A：试样中替米考星的峰面积；AS：标准溶液中替米考星的峰面积；m：试样质量，g。

2 结果

2.1 样品前处理方法的优化 参照农业部1025号公告—10—2008的方法，将样品前处理步骤进行优化，达到节省提取试剂、提高样品前处理质量和效率的目的，2种样品前处理方法比较如图1。

图1 2种前处理方法比较Fig.1 Comparison of two pretreatment methods

2.1.1 将样品提取步骤中称样量由“5.0 g”改为“2.5 g”，进行减半，同时将提取液用量也相应减半(乙腈由“8 mL”改为“4 mL”，磷酸二氢钾缓冲液由“5.0 mL”改为“2.5 mL”，水的总用量由“50 mL”改为“25 mL”)，从而减少试样及提取液的用量，节省试剂。

2.1.2 将振荡时间由“20 min”缩短为“10 min”，离心转速由“3 500 r/min”提高至“10 000 r/min”，由于转速的提高，将离心时间由“10 min”缩短为“5 min”， 从而减少样品前处理时间。

2.1.3 在“合并2次上清液，加40 mL水”提取步骤中，将“水40 mL”改为“乙腈饱和的正己烷10 mL”，由于鸡肉样品含有脂肪影响提取效果，采用乙腈饱和的正己烷则可去除脂肪等干扰物，有利于进一步净化，与水相比效果较好。

2.1.4 在样品净化过程中，将活化柱子的甲醇和水的用量、淋洗液中水和乙腈的用量均由“10 mL”减少至“6 mL”，与柱子本身的最大容量保持一致；将洗脱液的用量由“2.5 mL”改为“5.0 mL”，水浴温度由“30 ℃”提高至“50 ℃”，从而既保证目标成分从固相萃取柱上彻底洗脱，又缩短了氮吹时间。

2.2 方法的检出限 由于替米考星是顺反异构体的混合物，因此，在色谱图上存在顺式异构体色谱峰和反式异构体色谱峰。标准品和阳性添加样品中反式替米考星、顺式替米考星分别在10 min和12 min 左右出峰，空白试料对所测分析物无干扰，在该色谱条件下反式替米考星、顺式替米考星均得到很好的分离。根据样品进行标准物质添加回收率试验，以3倍信噪比可测得的最低质量浓度确定方法的检出限为10 μg/kg；替米考星标准溶液色谱图见图2，空白组织的色谱图及空白组织中添加100 μg/kg替米考星药物的色谱图见图3～4。

图2 替米考星标准溶液色谱图(0.5 μg/mL)Fig.2 Chromatogram of tilmicosin standard solution(0.5 μg/mL)

图3 空白样品色谱图Fig.3 Chromatogram of blank sample

图4 加标样品色谱图(100 μg/kg)Fig.4 Chromatogram of spiked blank samples(100 μg/kg)

2.3 方法的准确度、重复性和精密度 采用标准添加法，在空白组织中分别设计高、中、低3个水平浓度添加(50、100 μg/kg和200 μg/kg)的替米考星标准溶液进行回收率测定，每个浓度设定6个平行样品，同时进行空白试验，替米考星回收率达到92.3%～98.6%，相对标准偏差(RSD)为0.59%～0.74%，加标回收率试验结果见表1，由表1可知，不同浓度水平的添加，在鸡肉组织中回收率均达到90%以上，表明该方法测量准确度高、重复性好。取处理好的同一试样液注入液相色谱仪中，连续10次重复测定，计算出相对标准偏差(RSD)，精密度试验结果见表2，由表2可知，其浓度的相对标准偏差为0.54%，表明本方法有较好的测量精度。

表1 鸡肉中替米考星药物添加回收率试验结果Table 1 Results of spiked recoveries test of tilmicosin drug in chicken

表2 精密度试验结果Table 2 Results of precision test

2.4 与农业部1025号公告—10—2008方法比较 2种样品前处理方法及结果比较见表3。

表3 2种样品前处理方法及结果比较Table 3 Comparison of two pretreatment methods and results

2.4.1 采用农业部1025号公告—10—2008样品前处理方法，每提取1个样品，需要71 mL提取液，仅振荡和离心时间需要70 min；而优化后的方法则需要45.5 mL 提取液，振荡和离心时间需要33 min。因此，与农业部1025号公告—10—2008方法相比，优化后的样品提取步骤可以节省36%的试剂，缩短53%的提取时间。每净化1个样品，可节省试剂溶液13.5 mL；通过将水浴温度由30 ℃提高到50 ℃，在不影响净化效果的前提下，缩短氮吹时间约20 min。 同时，将提取液“水”更换为“乙腈饱和的正己烷”后，使鸡肉样品中脂溶性杂质进一步净化，使提取液清亮且容易通过固相萃取柱，避免柱子堵塞等现象，在氮吹时容易吹干，显著提高样品中目标物的回收率及稳定性。

2.4.2 与农业部1025号公告—10—2008方法相比，结果显示，鸡肉中替米考星药物添加回收率试验中，同样设置高、中、低3个水平浓度添加，其中样品中添加50 μg/kg回收率为68.7%～70.4%(RSD=1.41%)，添加100 μg/kg回收率为72.5%～75.7%(RSD=1.86%)，添加200 μg/kg回收率为76.4%～80.6%(RSD=2.11%)；而采用优化后的样品前处理方法时，3个水平浓度添加回收率均达90%以上(RSD<0.8%)，显著提高了检测结果的准确度及重复性。

4 结论

目前，鸡肉中替米考星残留的检测方法通常选用农业部1025号公告—10—2008《动物性食品中替米考星残留检测 高效液相色谱法》。刘勇军和姜艳彬(2012年)采用乙腈、水提取，3种添加浓度(0.05、0.10 mg/kg和0.15 mg/kg)回收率在73.1%～79.3%[1]；曹忠君(2014年)采用乙腈、磷酸二氢钾缓冲液、水进行提取，样品添加浓度为100 μg/kg时平均回收率为87.8%[3]；申惠敏和贾秀珍(2019年)综述了高效液相色谱法检测鸡肉中替米考星，样品采用乙腈、磷酸二氢钾缓冲液、水进行提取[4]。

本试验通过在农业部1025号公告—10—2008《动物性食品中替米考星残留检测 高效液相色谱法》基础上对样品前处理方法进行优化，建立了采用高效液相色谱法测定鸡肉中替米考星的最佳样品前处理方法，该前处理方法解决了农业部1025号公告—10—2008方法检测鸡肉样品时，提取液容易呈浑浊状态，直接进入固相萃取柱，堵塞柱子，净化效果不理想，氮吹不易吹干、氮吹时间长，回收率较低、不稳定等问题，显著提高了检测结果准确度、重复性，为鸡肉组织中替米考星的残留分析提供了可靠的分析方法。