新疆2种优势革蜱携带马梨形虫和饶氏立克次体病原的检测

李 敏，呼尔查，党娜娜，樊新丽，李才善，哈希巴特，巴音查汗

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052 ； 2.新疆和静县畜牧兽医站，新疆 和静 830014)

硬蜱是一类寄生于脊椎动物体表的吸血节肢动物，是许多自然疫源性疫病的传播媒介或贮存宿主，通过直接叮咬传播其所携带的病原体[1]。新疆昭苏县与和静县两地均常年雨水较多，草原面积较大，自然放牧家畜较多，随之硬蜱孳生也广泛，加之不同地区存在多种不同的优势硬蜱，其携带的病原种类也较为复杂，导致多种蜱传疾病流行[2]。

马梨形虫病是马梨形虫寄生于马、驴、骡等马属动物红细胞，通过媒介蜱叮咬而传播的一种血液原虫病，病原包括马泰勒虫和马驽巴贝斯虫，其主要症状为体温升高、黄疸、贫血和血红蛋白尿等，病情严重或治疗不及时可导致马匹死亡[3]。该病在世界各地广泛流行，在我国31省市几乎均有该病病原分离或疾病发生的报道，对我国畜牧业的生产造成巨大的经济损失，尤其马匹数量较多的新疆地区频发马蜱传血液原虫病，也成为了阻碍新疆马产业发展的重要因素之一[4]。饶氏立克次体是引起蜱传淋巴结炎和蜱传坏死红斑淋巴结病的病原，传染人可导致脑膜炎的发生[5]。新疆地处我国西部，在 “一带一路”战略实施的便利条件下，大型草食家畜及哺乳动物体表硬蜱的寄生及马梨形虫病和饶氏立克次体在昭苏伊犁马与和静县焉耆马群中的流行不仅阻碍了区域性养马业的发展，也对人类健康产生了危害[6]。近几年，新疆关于许多动物病原的监测多以血液为样本，对于以蜱虫为样品的蜱病原检测的报道较少。本试验在媒介革蜱种属鉴定及构建系统发育树的基础上，以2种当地优势种媒介生物为研究样本，通过PCR揭示不同硬蜱所携带蜱传病原的情况，从而为不同地区拟采取蜱传疾病的综合防控提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 2019年4月于新疆昭苏采集了雌蜱93只、新疆和静采集了95只寄生于马体表(颈部、背部及后腿内侧)的雌蜱，共188只成年雌蜱。树脂型基因组 DNA 提取试剂盒，购自北京赛百盛基因技术有限公司。RA-DIAL20 高速离心机，购自西班牙ORTO ALRESA公司；PCR仪和Gel Doc 2000紫外凝胶成像仪，购自美国Bio-Rad公司；DYCP-31DN型琼脂糖电泳仪，购自北京六一公司；2×EcoTaq PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司；DL2 000 DNA marker，购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 硬蜱样品DNA的提取 通过液氮将硬蜱组织研磨于1.5 mL，加入200 μL PBS缓冲液后，按照树脂型基因组 DNA 提取试剂盒说明书提取硬蜱的DNA，-20 ℃保存。

1.2.2 PCR扩增马泰勒虫、马驽巴贝斯虫和饶氏立克次体目的片段 扩增革蜱COI基因的引物参照文献[7]合成，对2个采样点的DNA进行Bc48、18S rRNA和16S rRNA基因扩增参照文献[8-9]，引物序列及反应条件见表1。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司进行引物合成。反应体系：2×EcoTaq PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL， DNA模板2 μL，ddH2O补足至25 μL。

表1 引物序列及反应条件Table 1 Primer sequence and reaction condition

1.2.3 PCR阳性产物的回收、纯化及测序 将COI基因、马驽巴贝斯虫和饶氏立克次体扩增的特异性条带切下，按DNA凝胶回收试剂盒的说明书将阳性DNA的条带进行回收，并将胶回收产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.4 蜱种及其携带病原的同源性分析 将测得的核酸序列在NCBI上用BLAST进行比对，找到与其相似的序列。利用MEGA 6.0软件对测得的序列进行序列比对并用最大似然法(Maximum likelihood,ML)构建系统发育树。

2 结果

2.1 优势分子生物学鉴定及其病原检测 以新疆和静、昭苏2个采样点的蜱DNA 为样品，用PCR方法扩增COI基因片段，经荧光成像可见，在700 bp左右出现目的条带，与预期结果一致(图1)；通过PCR扩增马驽巴贝斯虫、饶氏立克次体的部分基因片段分别在约450 bp、1 332 bp出现目的条带，与预期目的片段大小一致(图2、图3)，马泰勒虫未出现条带，最后经过测序得到以上2种病原的基因序列。

图1 COI基因的PCR扩增Fig.1 Amplification of COI gene by PCRM：DL 2 000 DNA 标准； 1～5：部分样品； 6：阴性对照M: DL 2 000 DNA marker; 1-5: Partial sample; 6: Negative control

图2 Bc48基因的PCR扩增Fig.2 Amplification of Bc48 gene by PCRM：DL 2 000 DNA marker； 1：阳性对照;2～5：部分样品; 6：阴性对照M: DL 2 000 DNA marker; 1: Positive control;2-5: Partial sample; 6:Negative control

图3 16S rRNA基因的PCR扩增Fig.3 Amplification of 16S rRNA gene by PCRM：DL 2 000 DNA marker； 1：阳性对照；2～9：部分样品； 10：阴性对照M: DL 2 000 DNA marker; 1: Positive control;2-9: Partial sample; 10: Negative control

2.2 新疆昭苏与和静2个采样点样品阳性率 通过PCR检测发现，昭苏采样点、和静采样点的马泰勒虫阳性率为0；2个采样点马驽巴贝斯虫阳性率分别为30.1%和6.3%；饶氏立克次体阳性率分别为6.5%和36.8%。见表2。

表2 2种优势硬蜱携带病原的阳性率Table 2 Positive rate of pathogen carried by two dominant Ixodidaes

2.3 2种优势硬蜱及其携带病原的进化分析

2.3.1 2种优势硬蜱的进化树分析 测序结果与GenBank公布的序列进行BLAST比对，昭苏阳性样品(seq1)测得序列与边缘革蜱(KF583568.1)的相似性最高，为99.85%，和静阳性样品(seq2)测得序列与森林革蜱的相似度最高，为98.83%。根据比对结果，下载革蜱属虫种同基因相关序列，以亚洲璃眼蜱为外类群，在MAGA 6.0软件中ML构建系统发育树。系统发育树结果显示，新疆昭苏与和静待鉴定蜱分别与边缘革蜱聚和森林革蜱聚为一支，分别与同种的中国新疆株(KF583568.1)和新疆株(MK307806.1)遗传距离最小。

图4 基于COI基因序列构建系统发育进化树Fig.4 Construction of phylogenetic evolutionary tree based on COI gene▲:本试验分离株▲:The strains isolated in this experiment

2.3.2 马驽巴贝斯虫和饶氏立克次体的检测分析 将病原阳性测序结果与GenBank公布的已知序列进行Blast比对，与马驽巴贝斯虫病原相似度较高的为中国新疆株(MK307869.1)和泰国株(KP162170.1)，相似度分别为98.45%和97.23%。与饶氏立克次体的序列相似度最高的是中国甘肃株(MH923224.1)和中国山西株(MH923214.1)，相似度均为99.66%。

3 讨论

据报道，北疆地区的优势种硬蜱包括草原革蜱、森林革蜱、边缘革蜱、银盾革蜱和巴氏革蜱等[10-11]；张桂林等[12]调查发现，山地森林和山地灌丛草原分布有森林革蜱和边缘革蜱2种硬蜱，随着生态环境的变化，硬蜱种类的形态也在不断变化。因此，本试验通过COI基因片段扩增了所采集硬蜱样品DNA，再与GenBank上的序列进行BLAST比对分析，结果显示，新疆昭苏与和静采样点优势种硬蜱分别与边缘革蜱和森林革蜱相似度最高。系统发育进化树也显示，两县采样点优势种硬蜱分别与边缘革蜱和森林革蜱的新疆株亲缘关系最近，与北疆优势硬蜱分布情况一致。

马梨形虫病在热带、亚热带和一些温带地区较为流行，且在世界范围内的流行与有效蜱媒介在世界范围内的分布是一致的，革蜱属、璃眼蜱属和扇头蜱属的蜱虫均可传播该病病原[13-14]。新疆昭苏与和静地区均为温带大陆性气候及其滋生的优势硬蜱，为马驽巴贝斯虫病的流行提供了适宜条件。2015年和静地区马泰勒虫和马驽巴贝斯虫的感染率分别为14.7%和58.8%[15]；2016年对昭苏进行分子生物学检测，马泰勒虫和马驽巴贝斯虫的感染率分别为36%和28%[16]。昭苏与和静是马泰勒虫病的常发地区，本试验使用与往年同样靶基因检测病原但结果有部分差异，可能与本试验采样范围单一的局限性和检测方法的灵敏度变化等方面的因素有很大关系，同一地区也可能因为不同的时间点和采样点检测到的病原携带情况不同。因此，马梨形虫每年的感染率都在不断变化，所以根据实时的病原检测的结果而不断地更改防控措施和有针对性的寻找防控重点地区是必要的。

2014年中蒙和中俄边境地区草原革蜱立克次体携带高达66.5%，2016年新疆哈巴河县边缘革蜱饶氏立克次体的感染率为17.6%[17-18]。本次试验中和静县试验点的森林革蜱所携带饶氏立克次体的阳性率为36.8%，是2016年哈巴河县的感染率的2倍，是本次试验中昭苏县试验点边缘革蜱的6倍。将经过16S rRNA扩增的序列比对，与甘肃相似度最高，这可能与新疆和甘肃地域相邻，气候、人类活动和动物迁移有关。蜱对环境变化也很敏感，所以作为媒介生物携带病原的情况也越来越复杂。因此，不断的监测每年动物携带蜱传疾病情况，明确动物疾病的媒介蜱种类是公共卫生安全的必要措施。在 “一带一路”战略实施的便利发展条件下，大型家畜及哺乳动物体表革蜱的寄生及其传播疾病感染率不断上升，成为严重阻碍新疆畜牧业和人类健康发展的重要因素之一，防蜱控蜱已成为畜牧业长期优质发展所迫切需要解决的问题。