MLST在乳酸菌鉴定及其多样性分析中的应用

赵尘培，姜琳琳，张建龙，陈国忠，于馨，朱洪伟，张兴晓

（鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类能够发酵糖类物质最终产物为乳酸的革兰氏阳性细菌。在细菌分类学上将乳酸细菌分为43个属，包括373个种及亚种[1]。目前，在食品工业领域应用最多的乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、肠球菌属、双歧杆菌属及片球菌属等。这些乳酸菌株可以定植在人和动物的肠道中，发挥免疫调节、抗氧化、降胆固醇及抑菌等功能。其中，乳酸菌在菌株水平上的分化是决定菌株功能差异性的重要因素。因此，在菌株水平上精确鉴定乳酸菌是非常重要的，可消除不同来源菌株对功能的影响。

随着分子生物技术的发展，基于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）发展起来的许多分子分型方法被用于乳酸菌及其亚种的分类鉴定及种群遗传进化分析研究。例如，基于16S rDNA测序、脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）以及聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,CAPs）等技术，对乳酸菌株的特异性鉴定具有重要意义。其中，16SrDNA技术难以区分近缘种或亚种，而其它分子技术依赖于电泳图谱，对工作量、辨识度、成本及重现性要求较高，使其应用受到局限[2]。而多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）技术依靠表征菌株不同管家基因位点的等位基因，可以区分不同菌株的序列类型（sequence type,ST）以及克隆复合体（clonal complex,CC），具有较高的区分性，已广泛用于致病菌的遗传多样性分析[3]。近些年该方法开始应用在非致病性食品菌株乳酸菌株的遗传多样性、种群结构及微进化研究中。

1 多位点序列分型（MLST）技术

多位点序列分型（MLST）是一种基于多个管家基因部分片段的核苷酸序列分析来区分相同微生物物种分离株的基因分型技术。近几十年，MLST已经发展成为监测细菌进化及遗传多样性的有效技术手段。最初Maiden等应用11个管家基因对107株脑膜炎奈瑟菌的菌株间等位基因多样性进行比较评估[4]，后来扩展到其它的细菌种类，来监测菌株种群内的基因重组现象，分析细菌种群结构的进化关系。MLST技术已成功被用于了解干酪乳杆菌(Lactococcus casei)、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)等诸多乳酸菌的群体遗传结构和进化关系。

1.1 MLST管家基因的确定

MLST用于表征细菌的遗传多样性，主要依赖于管家基因选择及其内部片段的核苷酸序列。管家基因是生物体细胞生命活动过程中稳定表达的一类基因。在MLST研究中，选择管家基因主要是由于核苷酸序列变异速率相对较慢，多态性相对于其它基因程度低，并且细菌不同菌株间在管家基因内仍具有足够的变异，在相同基因座上提供足够数量的独特等位基因，所以选择合适的管家基因在MLST中显得尤为重要。被选择的管家基因应为长度不短于1 kb单拷贝基因，具有编码蛋白的功能，并尽量涵盖整个染色体[5]。不同乳酸菌MLST方案管家基因的选择及数量见表1。

对于管家基因数量的选择原则是省时省力，并具有一定的分辨率以保证获得足够的序列型。所以综合考虑，一般6个～10个管家基因基本能够满足菌株群体变异分析的要求[14]。如表1所示关于乳酸菌的MLST分析中，管家基因的选择同样遵循上述原则。在植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）MLST方案中，设计了7个管家基因[15]，而在亲缘关系相近且样品来源特殊菌株的MLST分析中，例如发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）的研究中，管家基因设计为11个[16]。最后，目标基因的片段长度一般为450 bp左右，通过一些菌株分型的试验证明，该长度的目的基因足以用来监测物种的变异情况及系统发育关系。当然，随着高通量测序技术的发展，较长片段的基因检测已成为可能。在乳酸菌的MLST研究中，为了获取更多的遗传信息，人们开始选择600 bp～700 bp的目的片段[17-18]。

表1 不同乳酸菌MLST方案管家基因的选择及数量Table 1 Option and quantity of housekeeping genes in different lactic acid bacteria MLST schemes

1.2 MLST结果分析

多位点序列分型（MLST）技术流程图见图1。

如图1所示，MLST技术是以等位基因图谱和序列分型（ST）为基本分析单位。应用测序技术对目的基因序列进行分析，提交至MLST数据库进行比对，获得等位基因编号，所有等位基因的编号组成菌株最终的序列型。可将乳酸菌序列提交至PubMLST及BIGSdb等数据库。

图1 多位点序列分型（MLST）技术流程图Fig.1 Technical flow chart of Multi-site sequence typing(MLST)

在乳酸菌的序列分型中，若管家基因中有最多不超过2个位点等位基因不同，则可以聚集为一个克隆复合体（CC）[19]。例如在Bao等的副干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）MLST方案中，分析定义10个等位基因，确定了71个ST型和25个克隆复合体[7]。运用START、eBURST、MEGA、Sturcture、SplitsTree 等生物信息学分析软件，对序列进行分析。其中，先利用MEGA软件进行核苷酸序列比对，获得等位基因图谱；START软件主要分析多态性位点、核酸多态性（π）、G+C含量（%）等；eBURST软件对ST型进行克隆复合体归类分析；在Duan的研究中利用eBURST软件对马乳酒样乳杆菌（Lactobacillus kefiranofaciens）不同 ST型进行分析，确定了具有相同起源的菌株[20]。然后使用Sturcture及SplitsTree软件对分离菌株的遗传进化关系和种群结构进行分析。

2 多位点序列分型（MLST）技术在乳酸菌分类中的应用

乳酸菌具有较高的物种多样性，在食品工业及医学领域发挥重要作用，其分子水平上的鉴定，对该菌株的种群生物学研究具有重要意义。MLST最初应用于致病菌的进化和种群生物学研究，由于具有较高的分辨能力，已拓展至乳酸菌的多样性和系统进化分析。目前，MLST已用于乳酸菌的进化和种群结构分析，包括乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属等。

2.1 MLST在乳杆菌属（Lactobacillus）遗传多样性分析中的应用

MLST技术在乳杆菌属中的应用见表2。

新彩绘画起稿有大致几个步骤，起图、升图、作图、拍图、勾勒、上色等。起图是用单黑水绘制大概纹样，升图是用墨水与上勾勒一边，主要目的是为了画面更精细，把多余不需要的精细删减，对于绘制画面而言是一个提升的过程从而达到最后定稿的目的。作图是于后在瓷器上复出正稿，拍图则是需要大量批量，可以重复使用。

表2 MLST技术在乳杆菌属中的应用Table 2 Application of MLST in Lactobacillus

目前，MLST用于阐明乳杆菌属的进化和种群结构主要包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、清酒乳杆菌等。

最初，MLST用于从发酵水果和蔬菜以及青贮饲料、葡萄酒、泡菜和奶酪中分离的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的鉴定。由于受分离株数量的限制，对于植物乳杆菌的遗传多样性分析不够准确。2015年，Xu等采用8个等位基因的MLST技术分析了179株分离自不同地理区域、不同来源的植物乳杆菌及7株参考菌株，涵盖全部遗传多样性和种群物种的结构[11]。结果显示186株分离株具有73个不同的序列类型（ST），形成 10个克隆复合体（CCs），共有 158个多态性位点。系统发育树结果表明，来自相同生态位的植物乳杆菌分离株具有相似的遗传多样性和种群结构，对乳酸菌的微生态学研究具有重要意义。

2015年，Dan等首次利用MLST技术对203株发酵乳杆菌的11个管家基因进行多样性分析[8]，研究结果得到57个序列分型（ST），其中27株菌属于独立的序列型，表明具有高度的遗传多样性；系统发育分析表明，发酵乳杆菌的分离株主要分为两个主要类群，同一类群中的发酵乳杆菌分离株进化关系较近。另外，Sulaiman等利用MLST技术检测速食罐头中的发酵乳杆菌[16]，表明MLST技术中的管家基因可以为发酵乳杆菌的物种鉴定提供依据，并可用于罐头食品的安全监测项目。

干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌、玉米乳杆菌及副干酪乳杆菌中的其它亚种亲缘关系非常近，而传统的发酵特性很难进行区分，因此需要结合分子生物学技术对菌种进行鉴定。Feng等利用7个管家基因对100株来自西藏自然发酵乳制品的乳酸菌进行多样性研究，设计并创建了有针对性的MLST方案[23]。另外研究表明，增加dnaK基因可以明显区分出这4株菌。因此，dnaK基因可以作为干酪乳杆菌的一个附加分子系统发育标记，利用该基因测序可以很容易地解决这些菌株之间的系统发育关系[22]。这对干酪乳杆菌菌株的管理及溯源具有重要意义。

2.2 MLST在链球菌属（Streptococcus）遗传多样性分析中的应用

嗜热链球菌被美国食品药品监督管理（Food and Drug Administration,FDA）认定为链球菌属93个物种中唯一具有“安全”状态且在酸奶、奶酪和其他乳制品发酵中具有重要作用的菌株[42]。人们对嗜热链球菌的分离与研究工作开始于上个世纪初。最初通过分析对比16S rRNA和超氧化物歧化酶基因，认为嗜热链球菌与唾液链球菌亲缘关系相近，曾一度被划为唾液链球菌的一个亚种，直到1991年通过DNA-DNA重组试验才将嗜热链球菌恢复到种的水平。因此，分析嗜热链球菌的多样性及种群结构对于理解其生态进化及其在工业上应用非常重要。Yu等开发了10个管家基因的MLST分析方案[43]，对不同生态来源和地理区域分离的239株嗜热链球菌和36个全基因组菌株（18株嗜热链球菌，2株前庭链球菌和16株唾液链球菌）进行遗传多样性分析，结果表明，嗜热链球菌分离株的进化与地理位置有一定关系，但与发酵乳制品的类型无关。对36个全基因组菌株（18株嗜热链球菌、2株前庭链球菌和16株唾液链球菌）进行系统进化分析表明，MLST方案可以清楚地分离唾液链球菌的3个密切相关的物种，并且适合于分析种群结构，这对研究不同地理区域的嗜热链球菌菌株之间的系统发育关系具有重要意义。

2.3 MLST在乳球菌属（Lactococcus）遗传多样性分析中的应用

乳酸乳球菌属（Lactococcus lactis）包含乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp.cremoris）和乳酸乳球菌霍氏亚种（Laclococcus lactis subsp.hordniae）、Laclococcus lactis subsp.tructae 4个亚种。其中，Lactococcus lactis subsp.lactis与 Lactococcus lactis subsp.cremoris在乳制品的发酵生产过程中，尤其是在干酪的生产过程中，发挥重要的作用。所以，从食品工业和科学研究的角度，对这两个亚种的区分就显得尤为重要。

3 多位点序列分型技术（MLST）在乳酸菌基因组多样性分析中的应用

乳酸菌基因组上的遗传信息具有复杂性和多样性，而基因的遗传变异是追溯菌株进化发展的重要依据，因此乳酸菌基因组多样性也是关注的焦点之一。MLST技术虽然具有分辨率强、精确度高、数据可重复性好、菌株间数据可标准化等优点，但其毕竟只局限于基因组上的个别位点，有可能遗漏一些遗传信息，导致菌株间的亲缘及进化关系存在偏差。随着分子生物学及高通量测序技术的发展，比较基因组杂交（comparative genome hybridization，CGH）、随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）等技术成为提高其分辨力的良好补充。

唾液乳酸菌（Lactobacillus salivarius）是人类和动物的口腔及胃肠道中重要的益生菌。尽管从不同环境来源中分离出来较多的唾液乳杆菌，但是关于环境对菌株的基因组多样性的影响却缺乏相应的研究。Raftis等为了研究此问题[41]，应用MLST和比较基因组杂交技术（CGH），对来自人、动物或食品中的33株唾液乳杆菌进行基因多样性分析。MLST技术清晰地分离了人源和动物源菌株，而CGH方法基于对总基因组含量（包括小质粒）的分析，确定了18个主要的基因组变异区域及变异热点，表明唾液乳酸菌具有高水平的基因多样性，这些基因揭示了菌株之间具有的特异性特征，包括碳水化合物利用、细菌素及胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）的产生，这项研究有助于了解唾液乳杆菌基因组的进化规律与唾液乳杆菌生态位适应和益生潜力之间的关系。

2014 年，González-Arenzana 等研究发现 MLSTPFGE组合方法在30株酒明串珠菌（Oenococcus oeni）菌株鉴定上具有较高的分辨率[47]。MLST揭示了点突变以及少数基因中位点的缺失和突变，而脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）对大规模基因组重排更敏感。结果发现，两种分型方法的组合可以得到最多的基因型数量（22种）及多样性指数（ID值，0.947），这意味着PFGE和MLST技术组合可能会成为Oenococcus oeni菌株的可靠分型方法。

旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）是中国传统酸面团中的主要乳酸菌。Yang等通过多位点序列分型（MLST）技术和多重随机扩增多态性DNA聚合酶链反应技术研究来自不同区域的11个中国传统酸面团中98株旧金山乳杆菌的种内多样性[12]。MLST揭示了10种不同的序列型（ST），其中6种就包含79.8%的分离株，并且被归为同一种克隆复合体，表明它们之间进化关系相近。多重RAPD-PCR技术将98株旧金山乳杆菌分离株分为6种类型，相似度为70%。MLST与多重RAPD-PCR相比具有更高的区分能力，但是多重RAPD可以帮助区分同一ST型中的某些菌株。因此，在MLST和多重RAPD-PCR技术组合下，针对不同遗传变异，获得了旧金山乳杆菌的最佳基因型特征。

4 展望

近年来，随着乳酸菌的益生功能的不断研究，乳酸菌制剂的生产及销售量日渐增多，因此对乳酸菌菌株的精确鉴定及多态性研究已成为乳酸菌产业化的重要前提。MLST被认为是细菌基因分型技术中的金标准，在乳酸菌的种群结构及其遗传多样性的研究方面取得了一定的进展。然而，在过去的几十年中，MLST主要利用管家基因来进行菌株的分类及鉴定，而对菌株基因多样性与遗传背景的相关性缺乏研究。由于乳酸菌的益生功能受不同地理区域、不同来源及不同环境因子的影响，因此，以特定的功能基因为主要标记分子进行乳酸菌遗传多样性的分析，可以从不同的寄主和地理位置区分同一种属的乳酸菌，并可以鉴定与之密切相关的菌株，对乳酸菌益生功能的开发具有重要意义。MLST方法已经发展到基于几百个基因的核心基因组MLST（core genome MLST）到几千个基因的全基因组MLST(whole genome MLST)，这种大规模的MLST方案已被证明具有更高的分辨率。所以，可以将MLST技术与其相结合，全面、系统地了解乳酸菌基因组的结构和组成，健全乳酸菌不同种属的MLST数据库，促进世界范围内乳酸菌株的遗传进化研究。