食品接触材料中非故意添加物质分析方法的研究进展

■ 文/上海市质量监督检验技术研究院 李洁君，李文慧，石鎏杰

0 引 言

食品接触材料（Food Contact Materials, FCM）在运输和存储过程中对食品进行包装和保护，以延长食品的保质期，食品接触材料包括与食品接触的所有材料, 是由原材料和有意添加物质（Intentionally Added Substances, IAS）共同生产加工而成，添加IAS是为了提高食品接触材料本身的稳定性和机械性能，IAS包括单体，预聚物，抗氧化剂，润滑剂，表面活性剂和紫外稳定剂[1]。除IAS外，食品接触材料还可能含有非故意添加物质（Non-Intentionally Added Substances, NIAS），这些物质可能来源于包装材料与食品之间的化学反应的副产物或新形成的化合物、低聚物、降解产物[2]又或是其生产原料中存在的杂质[3]。NIAS的化学结构往往难以确定，需要使用高灵敏度分析技术。随着分析方法的进一步改进，今后将发现越来越多的NIAS。

关于食品接触材料的法规（欧盟法规10/2011）规定，在塑料材料和物品的生产和使用过程中会形成NIAS，只要最终食品接触材料中NIAS与风险评估有关，就应考虑将其列入限制使用物质清单内，制造商应根据国际公认的风险评估科学原则评估NIAS任何的潜在健康风险[4]。然而NIAS的分析是非常困难的，造成这一技术困难有几个原因。其一，缺乏食品接触材料生产制造中使用不同材料真实成分的信息，食品接触材料是一种非常复杂的结构，可以是共挤，也可以使用不同的粘合剂和不同的聚合物作为基材制造，还可以印上油墨，不可能知道食品接触材料涉及的每个细节。食品接触材料的成分通常是保密的，只声明食品接触材料的主要成分而不是所有成分，因而不可能知道食品接触材料所有的组成成分。此外，在食品接触材料生产制造过程中会有很多合作，如聚合物生产商或制造商和粘合剂、印刷油墨生产商。其二，食品接触材料复杂结构中，一些性能通常是由一些IAS决定的，如稳定剂、紫外线吸收剂、增塑剂和抗氧化剂。

通常情况下，很低的NIAS浓度会增加了分析的难度，因而需要复杂的分析技术，主要是基于质谱检测器和化学数据库的帮助来分析NIAS的分子结构。涉及安全性评估时，了解NIAS的来源是非常重要的。食品接触材料的可追溯性是强制性的，也包括NIAS。尽管存在上述困难，但是分析NIAS仍是一项需要解决的工作。一般认为分子量较大的NIAS没有扩散性，不会迁移到与其接触的食品中[2]。本文重点关注食品接触材料中分子量低于或等于1 000 Da的食品接触材料的NIAS，对其来源、分析方法、安全性评价进行了梳理与概述，以期为国内相关学者提供一定的参考依据。

1 NIAS来源

NIAS的来源多种多样，研究NIAS形成的不同途径将有助于分析NIAS。NIAS的来源分为以下几种：降解过程、IAS降解、杂质、新形成化合物、污染物。

1.1 降解过程

NIAS形成最常见的途径是降解过程。降解可以发生在食品接触材料本身。降解的主要来源包括食品接触材料在制造过程中暴露在高温或高辐照能量下，暴露在微波下[5]，辐照过程应用于食品的灭菌目的。在这些过程中形成分子量较低的新分子，这些分子具有较高的扩散系数，从而具有更高的迁移势能。已有一些研究报道了食品接触材料降解过程中会产生NIAS，大部分羰基化合物与聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene Ethylene Terephthalate, PET)热降解过程有关[6]。

食品的辐照还不是一种广泛使用的灭菌方式，在一些国家只适用于特定的食品，使用γ射线或β射线照射时有一个最大限量，通常为10 kg。关于这个问题的论文相对较少，Zygoura等人[7]对多层材料进行处理并研究辐照对聚氯乙烯（PolyVinyl Chloride, PVC）中增塑剂的影响。

1.2 IAS降解

降解也可以发生在用于改善其物理化学特性的IAS中。常用抗氧化剂的降解产物已被广泛研究[5,8]。这些抗氧化剂最常见的降解产物是2,4-二叔丁基苯酚、2,6-二叔丁基对苯醌、3,5-二叔丁基-4-羟基苯基丙酸、2,6-二叔丁基-4-甲氧基苯酚、3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲酸、磷酸三苯酯、磷酸三邻甲苯酯、磷酸二苯酯和3-(3,5-二叔丁基-4-羟基苄基)丙酸。其他因素如食品接触材料在微波加热下，可能导致抗氧化剂降解加快[5]。已研究的其他降解产物是烷基酚，壬基酚（NonylPhenol, NP）和辛基酚（OctylPhenol, OP），它们都是内分泌干扰物[6]。三（壬基苯基）亚磷酸三酯（Tris（NonylPhenyl）Phosphite, TNPP)是PVC、聚烯烃（PolyPropylene, PP)和丙烯酸等高分子材料中的抗氧化剂，TNPP氧化后可生成NP和OP。NP和OP也可以通过聚乙氧基化壬基酚的降解而产生，聚乙氧基化壬基酚是PET瓶制造中使用的清洁剂[9-10]。

1.3 杂质

在食品接触材料的迁移中发现NIAS的另一个常见原因是生产制造过程的生产原料中存在杂质。这些杂质在生产原料的信息数据表中没有提及，因而不可能事先知道它们的成分。Aznar等人[11]研究一些最近发表关于新型活性食品接触材料的文章，发现无论是在食品模拟物中还是在食品中都存在用于为食品接触材料提供活性特性的活性剂杂质。食品接触材料中使用的粘合剂IAS中的杂质也在迁移中被发现。丙烯酸胶黏剂的多层材料中迁移出2-乙基-1-己醇、2-乙基己酯和2,4,7,9-四甲基-5-癸基-4,7-二醇[12]。

1.4 新形成化合物

在迁移过程中发现对消费者健康有不利影响的反应产物是致癌化合物初级芳香胺（Primary Aromatic Amines, PAAs)，是聚氨酯（PolyUrethane, PU）粘合剂新形成的化合物。PU粘合剂是由多元醇和二异氰酸酯单体聚合而成，没有正确固化黏合剂，或者聚合反应不够充分，剩余的未聚合的芳香异氰酸酯将与水反应，产生PAAs[13]。一种来自PU粘合剂的新形成化合物是环己二酸1,4,7-三氧环十三烷-8,13-二酮，这种化合物很可能来自粘合剂配方中两种常见成分之间的相互作用[14]。

在其他食品接触材料如罐头的迁移过程中也发现了反应产物。环氧基漆通常用于食品罐头内的涂层，这些漆是环氧酚醛树脂，可能含有双酚A（BisPhenol A，BPA）和双酚A二缩水甘油醚（BisPhenol A Diglycidyl ether,BADGE)，在贮存过程中，涂层与酸性食品接触，BADGE会产生两种水解产物（BADGE·H2O和BADGE·2H2O）和两种氯羟基衍生物（BADGE·HCl和BADGE·2HCl），所有这些副产品都可能迁移到食品上[15]。BAMGE·H2O是BADGE的氧化形式，最近也在罐头涂层的迁移中被发现[16]。由于怀疑这类化合物具有基因诱变、毒性和抗雄激素性，近来引起了人们的关注[17,18]。Coulier等人[15]报道了BADGE与食物蛋白反应形成新的反应产物。

1.5 污染物

当回收材料用于食品接触材料时，NIAS可能来自先前食品接触材料的化合物，也可能是由于消费者在丢弃前误用食品接触材料而产生的化合物[19]。回收过程中存在固有污染物，化学添加剂及其降解产物也需加以考虑[20]。对PET回收材料迁移的研究进行研究[21]。纸和纸板[22-23]和PP[24]也被研究。

2 NIAS的分析方法

当食品接触材料的样品到达实验室后，最具挑战性和最困难的任务是采用合适的方法来分析。深入研究样品、材料和生产工艺对后续的分析有很大的帮助。气相色谱—质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)是分析NIAS最常用的技术。低挥发性、热不稳定性的NIAS不能用气相色谱法分析（Gas Chromatography，GC），但可以用液相色谱法分析（Liquid Chromatography, LC）。

2.1 挥发性NIAS的分析方法

GC-MS是小分子NIAS分析中最常用的技术，这种技术在商业的质谱库的辅助下分析NIAS是非常有效的，质谱库包含由电子碰撞（Electronic Impact, EI）和四极杆（Quadrupole, Q）质谱仪产生的质谱图。当使用离子阱（Ion Trap, IT）等其他质谱仪时，产生的质谱图与质谱库里的质谱图存在差异。使用IT质谱仪的优点是可以对选定质量的碎片进一步破碎，有助于更好地分析NIAS。当无法通过现有质谱库进行识别时，可以使用高分辨率精确质谱（High Resolution Accurate Mass Spectrometry, HRAMS）技术，如飞行时间（Time Of Flight, TOF），可以提供精确的质量测定和全光谱扫描，这有助于分析已知的NIAS。与GC相比，商用的HRAMS质谱仪耦合到LC更广泛[25]。

影响信号去噪的另一个关键因素是小波分解层次的选取,在选用同一小波基的前提下,不同的分解层次,信号的去噪效果也不同。表2列出了sym7和bior2.2两种不同小波基在不同分解层次下对模拟的加噪微流控芯片信号去噪效果数据。分析表2数据可知,选用4层分解可提高微流控芯片信号去噪效果。

通过与质谱库中质谱图比较确定的NIAS一般称为“初步确定”。一个完整的NIAS分析还需要进一步的数据。在类似条件下，将保留时间或是保留指数与之前已经公布的数据相匹配[26]，NIAS的质谱图和保留时间或是保留指数与文献中给出的NIAS相匹配就可确认该NIAS。使用自动质谱图解卷积和鉴定系统软件[27]是分析NIAS的有力工具。高分辨率精确质谱测定可以提供化合物的准确元素组成[14]。

具有不同电离模式的GC-MS方法是相互补充的，根据所涉及的NIAS的不同，反应也是不同的，而且仅靠其中任何一种方法都不能直接分析出NIAS。Felix等人[14]最近发表的论文中有一个例子，环内酯是一种来自粘合剂配方的NIAS，最终被确定为粘合剂中两种成分之间反应产生的副产品。表1概述了使用GC分析技术检测从食品接触材料中迁移出的NIAS。

表1 显示了使用GC分析技术检测从食品接触材料中迁移出的NIAS

NIAS 食品接触材料 分析方法 参考文献邻苯二甲酸二乙酯具有抗菌功能的新型活性纳米材料-氧化锌纳米颗粒与PP复合材料气相色谱-电子碰撞-四极飞行时间质谱（Gas chromatographyelectronic impact- quadrupole time-offlight mass spectrometry，GC-(EI)-QTOFMS）[13]三丙二醇二丙烯酸酯、10-二十碳烯开发的聚乳酸(polyactic acid, PLA)、丙烯和氧化锌纳米颗粒聚合物气相色谱-电子碰撞-四极杆静电场轨道阱质谱（Gas chromatographyelectronic impact-quadrupole-Orbitrap mass spectrometry，GC-(EI)-QOrbitrap-MS）[30]

2.2 非挥发性NIAS的分析方法

虽然挥发性NIAS样品处理方法也可以应用于非挥发性NIAS，但最终的仪器分析是完全不同的。使用LC分析NIAS需要进行预先分离。

虽然大量的检测器可以耦合到LC上，但是大多数检测器如紫外、荧光、红外等都不能提供足够的信息用于NIAS的分析，更多的是用于确认目的。液相色谱—质谱联用技术（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）可能是分析非挥发性NIAS最有效的技术。由于LC-MS技术缺乏完善的质谱库，鉴定过程比GC-MS技术更困难和耗时。LC-MS缺乏质谱库的主要原因是离子的强度会因仪器、电离源条件、流动相组成、缓冲液添加和样品成分的不同而不同，这些参数在实验室之间很难控制，而且它们在单一仪器中也随时间而变化[31]。

和GC一样，LC-MS可以使用不同的质谱仪。这些质谱仪包括Q和IT，或高分辨率质谱仪，如TOF。Q质谱仪具有较高的灵敏度和选择性，常用于定量研究，然而其在全扫描模式下的灵敏度和质量精度都有所降低，识别能力变得非常低。HRAMS技术的主要优势是可以在全扫描模式下进行精确质量测定，这使分析人员可以对未知NIAS进行结构解析。

不同的质谱仪都有各自的优点和缺点。质谱仪交替使用是为了将多种优点统一到一个仪器上。Q-TOF质谱串联或离子阱和飞行时间（Ion Trap and Time Of Flight,IT-TOF) 质谱串联能够对NIAS前体离子和产物离子进行精确的质量测定，能够提供碎片离子的信息，可以获得结构信息，NIAS可以表征[32-33]。

利用经验公式生成器软件确定前体离子的元素组成。确定元素的第一步是使用公式生成器软件选择质量相关联未知NIAS的元素，大量元素的组合会大大增加NIAS的可能性，因此第一种方法只包括有机分子中最常见的元素C、H、N、S和O，除非怀疑存在其他特定元素[31,34]。当NIAS的质量较大时，可能的元素组合也会增加[35]，在公式生成器提出的元素组成中选择质量误差最小、相对离子丰度比最接近的，NIAS存在特定同位素，如卤素，将容易分析正确的元素组成，从而减少NIAS的数量。然后通过化学数据库网站将元素组成与化学结构联系起来，从而选择NIAS。下一步是评估在高碰撞能谱中检测到的产物离子是否可以和待确定NIAS的化学结构相关联。最后在可能的情况下，通过使用标准物质来确认该NIAS。

当GC-MS还是LC-MS都无法识别NIAS，可以使用核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR)分析，它是一种能够分析化合物分子结构的强大检测技术，也是食品接触材料领域NIAS鉴定的有力技术[36]。使用NMR分析NIAS通常需要对样品进行分离纯化，需要使用制备LC柱收集组分。NMR分析需要高纯度和足够量的样品。NMR分析混合未知NIAS并没有很大优势。 表2概述了使用LC分析技术检测从食品接触材料中迁移出的NIAS。

表2 显示了使用LC分析技术检测到从食品接触材料中迁移出的NIAS

NIAS 食品接触材料 分析方法 参考文献环状化合物（内酯）多层包装材料（PE/铝和PE / (乙烯-乙醇乙烯共聚物ethylene-vinyl alcohol copolymer,EVOH） / PE/铝）UPLC-(ESI+)-QTOF-MS [44]29种低聚物都是羧酸与二醇的反应产物聚酯罐涂料 UPLC-(ESI+/-)-QOrbitrap [45]由残留的异氰酸酯衍生而来(含有PAAs)18层食品包装膜与PU粘合剂UPLC-(ESI+)-QTOF-MS [46]来自PU粘合剂的低聚酯2个含有PU粘合剂的多层袋UPLC-(ESI+/-)-QTOF-MS [47]

3 NIAS安全性评估

当在食品接触材料迁移化合物中分析出一个新的NIAS时，有必要对其安全性进行评估。对食品接触材料进行适当的安全评估不仅包括对生产原料的评估，还包括对NIAS的评估。

需要对食品接触材料的毒性进行几项研究。通常，仅凭识别出化合物的毒性数据是不可能完全解释食品接触材料的毒性。这就强调了分析NIAS的重要性，因为这些NIAS可能会影响食品接触材料的毒性。比如使用体外试验评估再生纸和原生纸的遗传毒性[48]中，只有一些迁移物质被鉴定出来。它们的浓度并不能完全解释所观察到总的遗传毒性[49]。

另一个例子是NP是TNPP的分解产物，是从食品接触材料迁移到食品的NIAS。NP的雌激素作用是众所周知的，并已在几个体外和体内试验系统中研究过[50]。

然而，现在还没有全部化学物质的毒性数据。当在食品模拟物或食品中检测和表征出NIAS时，如何评估这个NIAS所涉及的风险是个问题。一个选择是使用毒理学关注阈值（Threshold of Toxicological Concern, TTC）方法。TTC是根据克拉默规则，该规则根据NIAS的化学结构估计其理论毒性，对其进行分类，分成三类毒性：I、II和III。I类NIAS的毒性较低，II类NIAS的毒性中等，III类NIAS的毒性较高，建议第I、II和III类的最大摄入量为1.8 mg/人/天；0.54 mg/人/天和0.09 mg/人/d。Koster等人[51]提出了复杂混合物安全评估策略（Complex Mixture Safety Assessment Strategy, CoMSAS）来评估未知NIAS的安全性，CoMSAS是TTC方法的应用。该策略最重要的方面是没有必要识别迁移中存在的低于0.09 mg/人/d的未知NIAS。从FCM中使用的粘合剂中鉴定未知迁NIAS的研究中，采用了TTC方法分析鉴定出的NIAS，5个酰胺归为II类毒性[52]。

4 结 论

分析NIAS所面临的挑战是巨大的，取决于几个因素，如NIAS的性质，浓度，标准物质的可得性。许多可能的同分异构体、具有相似物理化学性质的NIAS将显著减少确认的可能性。需要样品处理过程，在分离和浓缩步骤尽可能多消除干扰，提高目标NIAS的浓度，软件工具和数据库信息以及高分辨率质谱对成功识别NIAS是必不可少的。

通过GC-MS分析挥发性NIAS通常更容易，因为可以使用质谱库帮助分析NIAS。当使用LC-MS分析NIAS时，这项任务更加困难和耗时，因为没有现成质谱库可用。在这种情况下，实验设计是非常重要的，许多因素可以影响最终的识别。

尽管NIAS的分析很复杂，但是最新分析技术的进步极大地促进了这一过程。开发强大的数据处理软件工具和增加化学数据库也是促进这项任务的必要条件。对食品接触材料中NIAS分析研究仍需进一步深入和拓展，以便为后续科学评估对人体健康的影响提供依据。