Box-Behnken 模型优化水麻叶总黄酮提取工艺及抗氧化活性分析

高林晓，马文升，石慧丽，郭 蒙, ，杨再波

（1.黔南民族师范学院化学化工学院，贵州都匀 558000；2.贵州省高校民族药用植物资源开发工程研究中心，贵州都匀 558000；3.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015）

水麻（Debregeasia orientalis）为荨麻科苎麻属落叶灌木，别名有柳莓、水麻桑、比满、沙连泡等。水麻主要生长在山坡、溪谷、河流两岸等潮湿地区，是我国西部与南部地区常见的一种药食两用的野生纤维植物，也是一种美丽的园林观赏树种[1−2]。其叶、根及根皮均可入药，微苦、辛，平。有消积，解毒，祛风除湿、消肿活血、风湿痹痛、跌打骨折等功效[3]。叶还可做饲料，果子可供食用、酿酒等[4]。

王国良等[5]研究发现水麻果提取物经纯化后具有强抗肿瘤作用。水麻叶中含有黄酮类、酚酸类、萜类等化合物，具有抑制疼痛、腹泻、抗肿瘤和抗菌等药理活性[6−7]。黄酮类化合物是一些具有相似化学结构且广泛存在于植物组织中的天然物质，常存在于植物的茎、叶、根、花和果实中，绝大多数黄酮类物质存在形式是与糖结合成苷类，其次是游离苷元，呈黄色或者淡黄色[8−10]。作为水麻叶中有效成分之一的黄酮类化合物，目前对其研究处于初步阶段，尚未见有水麻叶中黄酮的提取报道。

作为现代提取法之一的超声波提取法以其操作简便、快速、提取率高、绿色环保等优点，被广泛用于黄酮类、酚酸类等物质的提取[11−13]。超声波提取法是借助于超声波的空化现象、热效应和机械效应等作用破坏植物细胞组织，导致细胞壁破裂分解，另外超声波提取样品时，振动也会加速植物细胞内物质的扩散、释放和溶解等，从而可提高黄酮类化合物的提取率[14]。本文采用超声辅助提取水麻叶总黄酮，以总黄酮得率为考察指标，通过单因素和响应面试验优化水麻叶总黄酮提取工艺，同时对其抗氧化活性进行分析，以期为水麻自然资源的进一步研究和开发利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水麻叶 采自贵州省都匀市青云湖森林公园；芦丁对照品（含量≥98%）、维生素C（VC，含量≥98%） 合肥博美生物科技有限公司；2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ，含量≥99.0%） 阜阳曼林生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 合肥巴斯夫生物科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝等 均为分析纯。

T6 新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；KH2200DE 数控超声波清洗器 上海沪粤明科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水麻叶总黄酮提取工艺流程 水麻叶→晒干、粉碎、过筛→石油醚浸取→过滤→得滤渣→烘箱烘干（60 ℃）→称样0.5 g→超声提取→离心→总黄酮提取液。

将晒干的水麻叶粉碎，过60 目筛，得水麻叶粉末，分别取10 g 水麻叶粉末5 份放入带有具塞的250 mL 锥形瓶中，依次加200 mL 石油醚进行脱脂、脱色4 次，过滤，取水麻叶滤渣放置烘箱中烘干，常温下冷却后，混匀转移到保鲜袋中备用[15]。称取上述处理后的水麻叶粉末0.5 g 放置于25 mL 具塞比色管中。在一定乙醇浓度、液料比、超声时间和超声温度下（固定超声功率为100 W）进行总黄酮的提取，待提取液冷却到室温，在4000 r/min 条件下离心5 min，上清液即为样品提取液[16]。

1.2.2 单因素实验设计 称取0.5 g 水麻叶粉末5 份于具塞比色管中，固定液料比30:1 mL/g、超声提取时间30 min、超声温度30 ℃，分别测定乙醇浓度在15%、30%、45%、60%、75%、90%时水麻叶中总黄酮得率。

称取0.5 g 水麻叶粉末5 份于具塞比色管中，固定乙醇浓度45%、超声提取时间30 min、超声温度30 ℃，分别测定液料比在10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 和60:1 mL/g 时水麻叶中总黄酮得率。

称取0.5 g 水麻叶粉末5 份于具塞比色管中，固定乙醇浓度45%、液料比40:1 mL/g 和提取温度30 ℃，分别测定超声时间在15、30、45、60、75、90 min 时水麻叶中总黄酮得率。

称取0.5 g 水麻叶粉末5 份于具塞比色管中，固定乙醇浓度45%、液料比40:1 mL/g 和超声提取时间45 min，分别测定超声温度在20、30、40、50、60、70 ℃下时水麻叶中总黄酮得率。

1.2.3 响应面试验设计 根据单因素实验结果，以水麻叶总黄酮得率影响较大的水平作为参考。分别在乙醇浓度、液料比、超声提取时间、超声提取温度4 因素的基础上进行Box-Behnken 试验设计，各因素水平设计见表1。

表1 响应面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.4 水麻叶总黄酮的测定

1.2.4.1 芦丁标准曲线的制作 称取真空干燥至恒重的芦丁对照品0.0200 g，置100 mL 量瓶中，加3 mL 无水乙醇溶解，加蒸馏水至刻度，摇匀，即得0.2 mg/mL 芦丁对照溶液。

分别取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0 mL 0.2 mg/mL 芦丁对照溶液于25 mL具塞比色管中，分别加0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，后加4.0 mL 4%氢氧化钠溶液，用30%乙醇溶液定容至25 mL，摇匀后静置15 min后，在500 nm 测吸光度A[17−18]。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线回归方程为：A=12.7856C−0.0291，R2=0.9987。

1.2.4.2 总黄酮得率的测定 向25 mL 具塞比色管中准确移取1.0 mL 样品提取液，按照制作标准曲线的试验方法测定其吸光度。依据下式计算样品提取液中总黄酮提取率：

总黄酮得率（%）=（c×V×10−3）/m×100

式中：c：根据吸光度值和稀释倍数计算出的样品提取液中黄酮浓度，mg/mL；V：样品提取液体积，mL；m：称取水麻叶粉末质量，g。

1.2.5 总抗氧化性测定 取20 mmol/L FeCl3溶液、10 mmol/L TPTZ 盐酸溶液和pH3.6 的300 mmol/L NaAc–HAc 缓冲溶液按照1:1:10 的体积比配制，得FRAP 工作液，后置于37 ℃水浴中备用。

将4 mmol/L FeSO4标准储备液稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 等不同浓度FeSO4标准工作液。分别取200 μL FeSO4标准工作液、FRAP 工作液3.0 mL，蒸馏水1.9 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，混匀，37 ℃恒温反应10 min。蒸馏水做空白对照，分别测定593 nm 处吸光度值[19]。

取最佳工艺条件下样品提取液80 μL 于10 mL棕色容量瓶中，并加120 μL 蒸馏水稀释，此时对应的水麻叶中总黄酮浓度为0.4 mg/mL。后按照上述方法测定，得到以FRAP 值表示的样品总抗氧化能力，即由标准曲线算出对应的FeSO4浓度值后，换算为样品的FeSO4当量（mmol/L）。1 FRAP 单位等于1 mmol/L FeSO4，即样品的抗氧化能力相当于FeSO4的mmol/L 数。

1.2.6 DPPH 法抗氧化性测定 取0.75 mL 浓度为1.26×10−4mol/L 的DPPH 溶液与3.0 mL 无水乙醇混合、3.0 mL样品提取液与0.75 mL 无水乙醇混合、3 mL 样品提取液与0.75 mL 1.26×10−4mol/L DPPH溶液混合，分别在37 ℃下静置30 min，并以无水乙醇为空白，在517 nm 波长处测吸光度值，记为A0、Aj、Ai[20]。

DPPH 自由基清除率计算公式为：DPPH 自由基清除率（%）=[1−(Ai−Aj)/A0]×100。

同时，用上述的方法测定不同浓度VC的DPPH清除能力。

1.3 数据处理

实验数据重复测定三次，取平均值，并采用Microsoft Office Excel 2007、Design Expert 11.0 及Origin 8.0 软件进行实验数据的处理、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对水麻叶中总黄酮得率的影响 图1实验结果可知，乙醇浓度在45%时，水麻叶中总黄酮的得率最高。可能是因为乙醇浓度在45%时，溶液极性与水麻叶中黄酮类化合物相似，适宜其黄酮类化合物的溶出，而其他乙醇浓度时，极性相差大，黄酮类化合物溶出量少，或者其他杂质成分溶出量大都会导致水麻叶中总黄酮的量减少，从而黄酮得率下降[21]。由此选择乙醇浓度35%、45%、55%作为响应面分析的三个水平。

图1 乙醇浓度对水麻叶中总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in the Debregeasia edulis leaves

2.1.2 液料比对水麻叶中总黄酮得率的影响 图2实验结果可知，液料比在10:1～40:1 mL/g 之间，水麻叶中总黄酮得率呈上升趋势；液料比在40:1～60:1 mL/g 之间，水麻叶中黄酮得率反而下降；液料比40:1 mL/g 时水麻叶中总黄酮得率最高。可能是因为随着45%乙醇溶液用量的增加，有利于水麻叶中黄酮类化合物的溶出，当液料比继续增加大于40:1 mL/g 时，会导致其他醇溶类杂质的析出，所以水麻叶中黄酮类化合物的得率反而下降[21−22]。由此选择液料比30:1、40:1、50:1 mL/g 作为响应面分析的三个水平。

图2 液料比对水麻叶中总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of liquid to material ratio on the yield of total flavonoids in the Debregeasia edulis leaves

2.1.3 超声时间对水麻叶中总黄酮得率的影响 图3实验结果可知，超声时间在15～90 min 范围内，水麻叶中总黄酮得率呈先上升后下降趋势，超声时间45 min 时水麻叶中总黄酮得率出现峰值。可能是随着超声时间的延长，细胞内黄酮类物质充分与乙醇溶剂接触，有利于黄酮类化合物溶出，黄酮得率增大，但超声提取时间过长，则会导致其他非黄酮类活性物质溶出，或者部分黄酮类化合物发生分解，总黄酮得率下降[23]。由此选择超声提取时间35、45、55 min 作为响应面分析的三个水平。

图3 超声时间对水麻叶中总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ultrasound time on the yield of total flavonoids in the Debregeasia edulis leaves

2.1.4 超声温度对水麻叶中总黄酮得率的影响 图4实验结果可知，当超声温度从20 ℃上升到60 ℃时，水麻叶中总黄酮得率一直在增加，60 ℃时水麻叶中总黄酮得率最大；随着温度继续升高水麻叶中总黄酮得率反而下降。可能是因为超声温度适当提高可增强分子的渗透能力，有利于黄酮类化合物的溶出，但在温度稍高的状态下，一方面增大了反应体系中可溶性蛋白质的变性，使得整个体系的黏度增加，降低了黄酮类物质的溶出[24]；另一方面温度过高会导致部分黄酮类化合物结构不稳定分解，且溶液中杂质的溶出量也会增大，从而黄酮类物质的得率降低[25]。由此选择超声温度50、60、70 ℃作为响应面分析的三个水平。

图4 超声温度对水麻叶中总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasound temperature on the yield of total flavonoids in the Debregeasia edulis leaves

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 响应面试验设计及结果 以水麻叶总黄酮的得率为评价指标的响应值，选择乙醇浓度（A）、液料比（B）、超声时间（C）、超声温度（D）进行4 因素3 水平Box-Behnken 试验的优化设计，获取最佳提取水麻叶总黄酮的条件。Box-Behnken 试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 Box-Behnken 实验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

2.2.2 Box-Behnken 试验回归模型的建立及方差分析 以水麻叶中总黄酮得率为响应值评价指标，采用软件Design-Expert.V11 对表2 进行回归拟合统计分析，得到总黄酮得率（Y）的回归方程：Y（%）=−42.82196+0.37707A+0.37197B+0.47548C+0.53745D−2.5×10−5AB−4.0×10−4AC+4.0×10−4AD+7.5×10−5BC−7.5×10−5BD−4.0×10−4CD−4.46833×10−3A2−4.34333×10−3B2−4.64333×10−3C2−3.74333×10−3D2，方程中各项系数绝对值的大小表示此因素对总黄酮得率的影响，方程中各项系数的正负表示影响的方向[26]。

由表3 方差分析，模型的P值<0.0001，说明总黄酮得率与各自变量之间的回归关系极显著，回归方程能较好地模拟真实曲面[27]。失拟项P=0.3996>0.05，影响不显著，说明该试验模型与回归方程拟合度良好，试验数据和模型相符合的程度显著，可用此模型对水麻叶总黄酮得率试验进行分析和预测，且真实可靠。且决定系数R2=0.9947，调整决定系数Radj2=0.9893，表明此模型可用来解释98.93%总黄酮得率的变化，且两系数相差不大，说明此模型拟合程度高，误差小[28]，可用于水麻叶总黄酮得率的评价和分析。另外，A、B、C、D 一次项对总黄酮得率差异影响极显著（P<0.01）；AB、AC、AD、BC、BD、CD 交互项对总黄酮得率差异影响不显著（P>0.05）；A2、B2、C2、D2二次项对其影响极显著（P<0.01）。F值大小可以判断，四个因素对水麻叶总黄酮得率影响程度的大小为D（超声温度）>B（液料比）>A（乙醇浓度）>C（超声时间）。

表3 方差分析结果Table 3 Results of analysis variance

2.2.3 响应面试验中交互项作用分析 响应面试验中两因素交互项3D 图曲面的变化和等高线的变化见图5，3D 曲面图弧度变化越陡峭，等高线越密集且呈椭圆形或马鞍形时，且坡度、椭圆弧度越大，表示两因素之间交互作用越显著[29]。两因素对水麻叶总黄酮得率影响越大。从图5 可知，6 组等高线较密集且基本上呈圆形，6 组交互项3D 曲面坡度变化都比较平缓，说明总黄酮得率对该因素的变化不敏感，所以6 组因素对总黄酮得率的交互作用影响不显著，这与表3 方差分析的结果相一致。

图5 交互项对水麻叶总黄酮得率影响的响应面图Fig.5 Response surface diagram of the effect of interactive items on the yield of total flavonoids in the Debregeasia orientalis leaves

2.2.4 工艺优化条件验证 以水麻叶总黄酮得率为评价指标，通过Box-Behnken 模型优化分析得到提取水麻叶总黄酮最佳工艺的乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度分别为35%、42.52 mL/g、47.03 min、70 ℃。相应的水麻叶总黄酮得率预测值为3.13%。但考虑到实际操作的方便可行性，把最佳工艺条件最终调整为乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度分别为35%、42 mL/g、47 min、70 ℃。且三次平行试验验证得到水麻叶总黄酮得率为3.15%±1.82%，试验结果表明此提取工艺实测值与预测值相近，具有一定的实际应用价值。

2.3 总抗氧化性测定结果

FeSO4当量值大小可衡量样品总抗氧化活性的高低。最佳工艺条件下样品提取液的抗氧化性能换算为FeSO4当量值为1.969 mmol/L（据方程Y=0.7365X+0.0709（r=0.9982）），即此时样品的抗氧化能力与1.969 mmol/L 的FeSO4是相当的。因此，提取物总黄酮展现出较强的抗氧化活性。

2.4 DPPH 法抗氧化性测定结果

由图6 可知，随着总黄酮浓度从0.025 增加到0.10 mg/mL 时，其对应的DPPH 自由基的清除率从24.8%迅速地增加到64.2%，而浓度再继续增加到0.20 mg/mL 时，其值缓慢地增大到71.4%。但是，随着浓度继续增加时，清除率的值的变化的幅度比较小，最终基本保持恒定到77.4%。VC和提取液DPPH自由基清除能力的IC50分别为0.036 和0.075 mg/mL。由此可见，提取物黄酮类化合物可展现出好的清除作用[30]。

图6 DPPH 自由基清除作用Fig.6 Scavenging effect on DPPH free radical

3 结论

经过单因素实验优化分析结果，确定了Box-Behnken 模型的四因素三水平组合。经Box-Behnken模型试验优化，得到水麻叶总黄酮最佳提取条件的调整理论值，即乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度分别为35%、42 mL/g、47 min、70 ℃。FRAP 和DPPH 法测定结果表明水麻叶提取液中总黄酮具有较好的体外抗氧化活性及清除自由基能力。

本研究结果可为水麻质量标准建立提供理论上的数据支撑，还可为水麻这种野生植物资源的开发利用提供工艺方面的技术支持。此后还需对水麻叶中黄酮类化合物进行纯化和结构鉴定，并进一步研究黄酮类物质结构与抗氧化活性的关系。