从江香猪CAST 基因的组织时序表达规律分析

2021-06-19张富林杨启会孔德顺

中国畜牧杂志 2021年6期

张富林，杨洋，杨启会，孔德顺

（1.贵州农业职业学院，贵州贵阳 550025；2.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州贵阳 550025；3.贵阳市乌当区新堡乡农业服务中心，贵州贵阳 550025）

CAST 首次在1964 年被正式认定为钙蛋白酶系统的成员[1]，并于1979 年被命名为钙蛋白酶抑制酶[2]，主要在细胞信号传导、肌肉生长等过程中发挥功能作用。CAST 是一种内源性抑制蛋白，主要作用方式为该蛋白可以通过与被Ca2+激活的钙蛋白酶的特异性结合从而抑制蛋白酶的活性[3]。CAST 对肉质的嫩度和风味有着重要影响，通过对钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白活性的调节可实现对畜禽肌肉生长发育的调控，在畜禽肌肉组织中，钙蛋白酶系统控制着肌纤维蛋白的降解，在肌肉蛋白质降解的过程中起到限速的作用，尤其在宰后肌肉嫩度变化中起着关键作用[4]。目前，挖掘肉质性状调控基因或肉质性状连锁遗传标记是改良肉用家畜的有效途径[5]，CAST基因在家畜上的研究主要集中在该基因多态性与肉质性状的关联性上[6]。刘香等[7]通过对72 头苏太猪CAST基因的遗传多样性分析，发现在CAST基因的第6 内含子上MspI 酶切位点的3 种基因型间在肌肉的嫩度、pH 值、系水力水平指标上均差异显著。王华[6]等通过对5 个绵羊品种CAST基因多态性及其与肉品质的相关性分析，发现CAST基因可作为绵羊产肉性能和肉品质的分子标记辅助。以上研究结果表明CAST基因对家畜肉质性状具有一定的影响，从江香猪作为贵州优质的地方资源品种，具备体型矮小、肉质香嫩、基因纯合、纯净无污染等特点，对于CAST基因在从江香猪组织中的时序表达未见报道，本实验以贵州从江香猪为研究对象，采用荧光定量PCR 技术对从江香猪不同月龄组织中CAST基因的表达进行检测分析，以期为进一步研究CAST基因对从江香猪肉质性状的调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样本采集采集1、3、6、9、12 月龄从江香猪的心肌、肝脏、骨骼肌、背最长肌和脂肪5 个组织样本，置于液氮中保存。

1.1.2 主要试剂 TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇购自莫纳生物科技有限公司（珠海）；逆转录试剂盒购自百乐科技有限公司；实时荧光定量试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；琼脂糖购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要仪器超净工作台购自全净净化科技有限公司；实时荧光定量PCR 仪购自广州安邦生物科技有限公司；凝胶成像系统购自上海培清科技有限公司；PCR仪购自中康中卫（上海）生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 组织总RNA 的提取及逆转录采用TRIzol 法提取样本总RNA，总RNA 提取完成后，使用紫外分光光度计对其浓度和纯度进行检测，检测完成后使用ddH2O 将其浓度稀释到同一水平后备用。使用逆转录试剂盒将提取的RNA 进行逆转录，逆转录反应体系20 μL：提取的RNA 模板1.5 μL、Primer Mix 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、5×RT Buffer 4 μL、Ribo Lock RNase Inhibitor 1 μL、Revert Aid M-Mu LV RT 1 μL、无酶水9.5 μL。逆转录条件设置为65℃变性5 min，42℃孵育60 min，70℃失活反应5 min。

1.2.2 引物设计与合成根据NCBI 上猪CAST基因的mRNA 序列（登录号：NM_214067.1），通过Primer 5.0软件进行引物设计，并交由上海英俊生物技术有限公司合成，引物序列信息见表1。

表1 CAST 基因引物信息

1.2.3CAST基因的克隆与检测以从江香猪背最长肌cDNA 为模板进行CAST基因的克隆。克隆体系20 μL：上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 模板（20 ng/μL）1 μL、DNA 聚合酶10.0 μL、ddH2O 7 μL。反应条件为95℃预变性4 min，95℃变性35 s，57℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35 个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并将产物进行测序。

1.2.4 实时荧光定量PCR 将1.2.1 中获得的cDNA 进行实时荧光定量PCR 反应，反应体系10 μL：SsoFast EvaGreen Supermix 5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 模板（100 ng/μL）2 μL，ddH2O 2 μL。实时荧光定量PCR 反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，59.5℃退火30 s，循环40 次后进行熔解曲线分析，以每5 s 上升0.5℃的速率从65℃升高到95℃。荧光信号在每个循环结束时检测，每个样品做3 个重复。

1.3 统计分析采用2-∆∆Ct方法对qRT-PCR 结果进行分析，利用SPSS 18.0 软件对实验获得的实时荧光定量PCR 结果进行单因素方差分析，P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1CAST基因CDS 区的克隆将扩增得到的产物经1.0% 琼脂糖电泳鉴定，结果显示条带单一，并且与预期大小一致（图1）。

图1 CAST 基因PCR 扩增电泳图

2.2 从江香猪不同时间段相同组织CAST基因表达分析经测序比对，克隆的CAST基因扩增结果与设计合成序列一致，且CAST基因内参GAPDH基因的扩增曲线均呈现S 型，拐点清晰，并且熔解曲线均只有一个峰，说明荧光引物特异性较好，实验结果可靠（图2）。由图3 可知，在心脏组织中，CAST基因的表达量由高到低依次为6、12、9、3、1 月龄（P＜0.01）。在肝脏组织中，CAST基因的整体表达趋势呈现先增高再减少，且在3、6 月龄的表达量极显著高于1、9、12 月龄。在骨骼肌中，CAST基因在9 月龄的表达量最高（P＜0.01），12 月龄表达量极显著高于6、3、1 月龄，1 月龄和3 月龄表达量无显著性差异。在背最长肌中，CAST基因在9 月龄表达量最高（P＜0.01），6 月龄表达量极显著高于12、1、6 月龄，1 月龄和6 月龄表达量无显著性差异。在脂肪中，CAST基因在9 月龄表达量最高（P＜0.01），其次由高到低依次为6 月龄、12 月龄、3 月龄、1 月龄，1 月龄极显著低于其他月龄。

图2 CAST 基因和GAPDH 基因的扩增曲线及熔解曲线

图3 CAST 基因在相同组织中不同月龄之间的表达量差异

2.3 从江香猪相同月龄不同组织中CAST基因的表达分析相同月龄不同组织中实时荧光定量PCR 结果如图4 所示，在不同月龄的心脏、肝脏、骨骼肌、背最长肌和脂肪中CAST基因均有表达，说明该基因在从江香猪各组织表达具有广谱性。1 月龄时，CAST基因在背最长肌中的表达量最高，极显著高于其他组织，肝脏中表达量最低。3 月龄时，CAST基因在心脏中的表达量最高（P＜0.01），背最长肌中的表达量与骨骼肌无显著差异，但两者表达量均极显著高于脂肪和肝脏组织，在肝脏中表达量最低。6 月龄时，CAST基因表达由高到低为心脏＞骨骼肌＞背最长肌＞脂肪＞肝脏（P＜0.01）。9 月龄时，CAST基因表达量为骨骼肌＞背最长肌＞心脏＞脂肪＞肝脏（P＜0.01）。12 月龄时，CAST基因表达量为骨骼肌＞心脏＞背最长肌＞脂肪＞肝脏（P＜0.01）。

图4 CAST 基因在相同月龄不同组织中的表达差异

3 讨论

CAST基因作为一种钙蛋白酶依赖的特异性抑制剂，广泛存在于动物体内，有研究显示通过对钙蛋白酶-钙蛋白酶抑素系统的活性改变可以调控肉的嫩度[8]。本实验结果显示，CAST基因的mRNA 在从江香猪心脏、肝脏、骨骼肌、背最长肌和脂肪5 个组织的不同时间段均有表达，这一结果与CAST基因在其他哺乳类及禽类动物中的研究结果相符[9-12]，说明CAST基因在家禽及家畜不同组织中的表达均具有广谱性，也进一步证实了钙蛋白酶抑制酶在猪细胞中是普遍存在的。本研究结果显示在幼龄从江香猪各组织中CAST基因的表达量均不高，但均有表达，这一结果与李武峰[13]等对广灵驴组织中CAST基因的表达研究一致；随着年龄的增长，在从江香猪不同年龄段CAST基因在脂肪中的表达量始终相对较低，而在心脏、骨骼肌、背最长肌中的表达量显著增加。管凇等[13]研究显示与幼龄阶段黑山羊相比CAST基因在成年后的黑山羊心肌、肝脏、骨骼肌中的表达量显著增加，但在脂肪中的表达量始终相对较低，这与本研究结果基本一致，说明CAST基因可能在调控肌肉的剪切力及嫩度方面具有一定作用，同时也揭示了CAST基因可能会对从江香猪肌肉剪切力和嫩度存在调控作用。本实验对从江香猪不同月龄各组织间表达量进行比较分析发现，心脏、骨骼肌和背最长肌为CAST基因的优势表达组织，这与肖蔹[10]在山地乌骨鸡中对CAST基因的研究结果一致。本研究显示在从江香猪3 月龄和6 月龄，CAST基因在各组织中的表达总趋势为心脏＞骨骼肌＞背最长肌＞脂肪＞肝脏，且各组织间表达差异极显著，这与刘安芳[14]报道的CAST基因在艾维茵祖代肉种鸡、宝万斯尼拉祖代蛋用种鸡以及四川大恒家禽育种公司培育的并经过四川省品种委员会审定通过的优质鸡纯AB、D 系祖代种鸡等品种中的肌肉组织中表达量显著高于其他组织的结果存在差异，可能是实验品种及所测定样品的月龄不同等导致；而在其余时间段显示CAST基因在骨骼肌及背最长肌中的表达量较高，这一结果与刘安芳[14]研究结果相似。Ciobanu 等[15]发现猪CAST基因与系水力、嫩度、蒸煮损失等肉质性状显著相关，对猪肉的pH 影响较小。综上可知，CAST基因可能是影响从江香猪肌肉剪切力和嫩度的主效控制基因。