镉暴露对鲤脂代谢的影响

任艳华,李 慧， 张隽美， 张玉茹＊

（1.河南师范大学水产学院，河南新乡453007；2.河南省水产动物养殖工程技术研究中心，河南新乡453007）

近年来，随着生产力的发展，重金属加重了对河流、湖泊等水体的污染程度，成为水生生态环境的持久性污染物。其中，镉作为一种有毒的重金属，通常以离子的形式存在于环境中，由于其半衰期长，不易被降解，会随着废水等进入湖泊河流等水环境并进入生物链，并在人及动物体内蓄积，对人及动物的健康带来极大的危害。已有研究表明，长期暴露在镉等重金属污染水体中的鱼类，呈现代谢紊乱、免疫功能紊乱、肝脏和肾等器官病变等症状[1,2]。2012年，研究者对东北三省3种鱼的肌肉样品检测时发现，镉在鲤鱼、草鱼、鲫鱼中超标，超标率高达1.1%，其中鲤鱼肌肉中镉平均含量为0.01 mg/kg[3]，其含量接近珠江三角洲鲤鱼中镉的平均含量（0.01 mg/kg）[4]，低于太湖中鲤鱼肌肉镉的平均含量（0.014 mg/kg）[5]。可见，鱼体内镉含量存在超标现象，镉对鱼类生长、代谢和免疫功能等的影响已引起人们的重视。但是，目前的研究多集于镉对水生动物免疫毒性的研究，较少的从鱼类脂代谢的角度进行研究，亟需深入研究。

2018年，全球鱼类产量大约为1.79亿吨，8210万吨来自水产养殖，其中鲤鱼（Cyprinus carpio）的养殖量达到了418.95万吨[6]。鲤因其体态丰满，肉质肥厚，细嫩鲜美，营养丰富而成为我国重要的淡水养殖鱼类，由于它们对污染的水环境具有较强的抵抗力，而被用作了解环境污染的生物指标物种[7,8]。据此，本实验通过模拟水体中镉的浓度，进行为期30 d的Cd2+暴露实验，评价镉对鲤肝体比、脏体比、肝脏脂肪蓄积、肝脏和肌肉脂肪酸成分和含量的影响，以期为防治水体镉污染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验选用平均体重约80 g的健康鲤于河南师范大学水产学院养殖系统暂养2周开始正式实验。参照中国渔业水质标准(GB11607-89)规定镉浓度不超过0.005 mg/L。确定Cd2+的实验组浓度分别为0.005 mg/L Cd2+、0.05 mg/L Cd2+、0.5 mg/L Cd2+，另设一个对照组（清水）。将驯化后的鲤鱼随机平分为4组，每组3个重复，每3 d换1/2的水，每次加入不同浓度的CdCl2。每天两次按照鲤鱼体重的1.5%进行投喂商业颗粒饲料，剩余的饲料残渣捞出，水温在（18±2）℃，pH控制在7.0±0.1之间，饲养30 d。

1.2 样品收集

实验结束后，用浓度为40 mg/L的MS-222对所有鱼进行麻醉，每桶随机选取5尾进行称重和体长测量，并解剖分离出内脏，液氮速冻后置于-80℃保存，用于不同组织脂肪酸的测定。另外，每桶随机挑取3尾，取其肝脏，一部分置于4%多聚甲醛溶液中用于苏木精-伊红（HE）染色切片的制作，另一部分用于油红染色切片的制作。

1.3 肝体比和脏体比测定

生长及生物学性状计算公式：

肝体比（hepato-somatic index，HIS，%)=Wl/Wt×100

脏 体 比 （viscera-somatic index，VSI，%）=Wv/Wt×100

式中，Wt为终末体质量(g)，Wl为肝脏湿重（g）。

1.4 组织切片制作

每桶随机挑取3尾，取其肝脏，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，参照《临床病理学技术》中的操作规范，对鲤肝脏组织样品进行石蜡包埋、切片，进行苏木精－伊红(HE)染色及油红染色，并于显微镜下阅片观察鲤肝组织的形态变化。

1.5 不同组织脂肪酸含量分析

每个样品称取2.0-3.0 g，每组做4个重复。用氯仿/甲醇(2:1,v/v)溶液萃取样品中脂质，使用美国Agilent 7890B气相测谱仪（配置100 m HP-88石英毛细管柱）测定肝脏和肌肉全脂的脂肪酸成分，采用百分比的方法计算组织中脂肪酸含量。

1.6 数据处理

使用EXCEL 2019分析处理实验数据，使用SPSS 22.0的单因素方差对生长性能指标数据进行显著性检验和多重比较；此外，由于脂肪酸提取过程中少量实验数据缺失，致使各组织脂肪酸数据与基因表达数据个数不完全一致（非均衡数据），无法用方差分析进行统计分析，因此使用SAS9.0软件包对肌肉和肝脏脂肪酸成分进行最小二乘分析和多重比较，不同组织脂肪酸成分表示为最小二乘均数±标准误(LSMEAN±SE)。

2 结果与分析

2.1 镉对鲤肝体比及脏体比的影响

肝脏是鱼类代谢的主要器官，肝体比和脏体比是毒理实验中常用的指标，能够反映脏器的健康状态。因此，本实验测定了鲤的肝体比与脏体比（表1），随着水体中镉浓度的增加，肝体比逐渐降低。当水体镉浓度为0.05 mg/L时，鲤鱼的脏体比显著低于对照组和0.005 mg/L处理组中的对应值。与之类似，当水体中镉浓度从0.05 mg/L增加至0.5 mg/L时，鲤鱼脏体比显著升高。

表1 镉暴露对鲤肝体比和脏体比的影响

2.2 镉对鲤鱼肝细胞形态和脂质蓄积的影响

为了检测镉暴露是否会对鲤肝细胞造成损伤以及肝组织脂质蓄积，本实验取了鲤的肝脏组织，分别使用苏木精-伊红（HE）和油红染色检测分析鲤肝细胞形态、肝脂沉积的情况。电子显微镜下观察发现：与对照组相比，不同浓度镉暴露之后鲤鱼肝细胞边界清晰，细胞核处于细胞中心位置，肝细胞大小无明显变化，细胞核大小无明显变化且肝脏脂滴无明显增多（图1）。说明镉处理并未影响肝脏的脂肪蓄积。

图1 镉暴露对鲤肝细胞形态和脂肪含量的影响(10×40)

2.3 镉对鲤鱼肝脏及肌肉脂肪酸成分及含量的影响

脂肪酸的合成与分解代谢在维持机体稳态过程中起着重要作用，且脂肪酸在脂质的合成、分解和转化的过程中有重要的调控作用，为了探讨镉暴露对鲤脂肪酸代谢的影响，本实验分析了不同浓度镉暴露后鲤关键脂代谢组织肝脏和脂肪主要蓄积组织肌肉中的脂肪酸成分和含量。

分析鲤肝脏脂肪酸组成成分发现（表2，图2），不同浓度镉暴露后对鲤肝脏C16:0、C18:1n9、C18:3n6、C18:3n3、C20:0、C20:2、C20:3n6、C20:4n6、C22:6n3、∑SA、∑PUFA/∑SA和∑N6/∑N3均无显著影响（P＞0.05）；与对照组相比，0.005 mg/L与0.05 mg/L镉暴露显著降低了鲤肝脏C14:0的含量；0.005 mg/L组鲤肝内C16:1n7含量增加，但随着水体中镉浓度的增加，其含量逐渐降低；0.005 mg/L组鲤肝内C18:1n7含量显著高于0.05 mg/L组（P＜0.05），但与其他各组差异不显著（P＞0.05）；0.05 mg/L镉暴露后，鲤肝内C18:2的含量显著高于其它组（P＜0.05）；随水体中镉浓度的增加，鲤肝内C20:5n3的含量逐渐增加，0.5 mg/L组鲤肝内C20:5n3含量显著高于对照组和0.005 mg/L组对应含量（P＜0.05）；0.05 mg/L组鲤肝脏∑PUFA的含量显著高于对照组和0.005 mg/L组（P＜0.05）。

表2 不同浓度镉对鲤鱼肝脏脂肪酸含量的影响

分析鲤肌肉脂肪酸组成成分发现（表3，图2），不同浓度镉暴露后对鲤肌肉C14:0、C16:0、C16:1n7、C18:0、C18:1n9、C18:1n7、C18:2、C18:3n6、C18:3n3、C20:0、C20:2、C20:4n6、∑SA、∑PUFA、∑PUFA/∑SA、∑N6和∑N6/∑N3均无显著影响（P＞0.05）；0.5 mg/L镉暴露后，肌肉中C20:3n6的含量显著高于0.05 mg/L组（P＜0.05），0.005 mg/L和0.05 mg/L组鲤肌肉C20:3n6低于对照组，但并无显著差异（P＞0.05）；随水体中镉浓度的增加，鲤肌肉C22:6n3的含量逐渐增加，0.05 mg/L组鲤肌肉C22:6n3显著高于对照组（P＜0.05），但当浓度超过0.05 mg/L之后，肌肉中其含量降低。0.5 mg/L组肌肉∑N3含量显著低于0.05 mg/L组（P＜0.05），0.05 mg/L和0.005 mg/L与对照组鲤肌肉∑N3无显著变化（P＞0.05）。

此外，分析肝脏和肌肉各对照组中脂肪酸含量发现，肌肉中C14:0、C16:0、C18:0含量显著低于肝脏中的含量（P＜0.05）；同时，肌肉中∑SA显著低于肝脏中的值（P＜0.05）（图2）。但两组织中∑PUFA含量差异不显著。

图2 镉对鲤鱼肝脏及肌肉脂肪酸成分的影响

3 讨论

镉在自然界中普遍存在，作为人体蛋白质主要来源之一，鱼体中的镉会随食物链最终进入到人体，危害人体的健康。研究发现，人摄入镉后，镉主要蓄积在人体肝脏和肾脏内，并对多种器官造成负面影响。对哺乳动物的研究也发现，将小鼠的肝细胞进行不同浓度的镉暴露后，随着镉浓度的升高，肝细胞的死亡率逐渐增加[9]。水生动物普遍可以吸收镉，镉不仅会对水生生物的生长及存活带来不利影响，还会对渔业生产造成阻碍。已有的水生生物研究发现，1.6 mg/L镉暴露30 d后，鲫鱼肝组织超氧化物歧化酶显著降低[10]，镉浓度从0.2 mg/L增加至1.6 mg/L时，鲫鱼肝丙二醛（MDA）的含量逐渐增加[11]，表明镉暴露能够引起红鲫脂质过氧化肝损伤，从而损害鱼体健康。镉暴露5周后，雄性食蚊鱼肝质量和肝腺指数有所增大，但对雌性食蚊鱼无显著影响[12]。0.025 mg/L镉暴露12周后，稀有鮈鲫内脏团重显著降低[13]。

与上述研究不同，本实验中，随着水体中镉浓度的增加，肝体比逐渐降低，当水体镉浓度为0.05 mg/L时，鲤鱼的肝体比显著低于对照组和0.005 mg/L处理组。且脏体比有类似趋势。这可能与不同种的鱼类对镉的毒性具有不同的敏感性有关。

此外，经过镉暴露的小鼠肝脏与对照组小鼠肝脏相比，出现纤维化现象[14]。0.005 mg/L与0.025 mg/L镉暴露后，稀有鮈鲫肝组织形态与正常对照组相比无显著变化，0.05 mg/L时，肝脏开始出现病变[13]。在本实验中镉暴露对鲤肝组织形态结构无显著变化，推测可能原因为黄河鲤对镉暴露的耐受强，本实验中镉暴露浓度不足以导致肝脂质的蓄积及肝损伤。

镉暴露对脂肪酸代谢有很大影响，且存在复杂的相互作用。已有研究发现，镉(300 mg/L，暴露6周)上调了鱼肝脏长链脂肪酸延长酶elovl2活性，但这种上调并没有伴随着多不饱和脂肪酸的显著增加，且300 mg/L镉暴露后并没有显著影响虹鳟肝脏脂肪酸含量[15]。上述实验结果与本实验中肝脏和肌肉中脂肪酸含量基本相符。