重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10和11kDa 蛋白的动物效力分析

卢锦标，都伟欣，苏城，沈小兵，陈保文，蒲江，赵爱华

1.中国食品药品检定研究院结核病疫苗和过敏原产品室中国医学科学院生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室,北京102629；2.安徽智飞龙科马生物制药有限责任公司,安徽合肥230039

纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)皮肤试验自问世以来,一直是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染筛查的主要手段,由于其操作简单,成本低廉,可实现基层大规模人群检测,因此被广泛用于结核病的诊断和流行病学调查［1］。但随着卡介苗(BCG)的大规模应用,PPD 的缺陷开始显现。由于共享抗原谱,PPD 不能区分Mtb感染和BCG 接种,因此特异性较差。近年发展起来的新型体外诊断方法——γ 干扰素释放试验(interferon gamma release assay,IGRA),采用Mtb 特异性抗原,解决了PPD 特异性低的问题。早期PPD 皮肤试验用于Mtb 潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)调查,并据此估计世界约 1 ／ 3 人口为 LTBI［2］；而目前采用IGRA 筛查的LTBI 数据估计明显低于此比例［3］。但IGRA 对实验技术和条件要求较高,且价格较贵,世界卫生组织并不推荐将IGRA 作为低收入国家和一些中收入国家的Mtb 感染者的筛查手段［4］。我国作为BCG 普遍接种国家,也是结核病高负担国家,LTBI 人数巨大,需要简便、特异和高通量的新型诊断方法［5］。

借鉴传统PPD 的皮试方法,本实验室早期选择Mtb 中存在而BCG 中丢失的east6 基因,研发了第一代Mtb 感染鉴别抗原11kDa［6］；之后通过增加新抗原CFP10,以提高制剂的灵敏度,构建了第二代Mtb感染鉴别抗原重组ESAT6-CFP10 融合蛋白(简称EC)［7-9］。在临床前研究中,本文以BCG 致敏豚鼠和PPD 试剂为对照,平行比较了11kDa 和EC 对Mtb 感染豚鼠的检测效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级 Hartley 豚鼠,雌性,18 只,300 ～400 g ／ 只,由中国食品药品检定研究院实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SYXK(京)2014-0013,在该院分枝杆菌专业实验室的负压动物房饲养。

1.2 菌株及疫苗 Mtb H37Ra(CMCC93020)由中国医学细菌保藏管理中心提供,培养后用比浊管比浊浓度,用生理盐水稀释至 2 mg ／ mL；BCG 由中国食品药品检定研究院结核病疫苗和过敏原产品室制备,浓度为 2 mg ／ mL。

1.3 主要试剂 EC 由安徽智飞龙科马生物制药有限公司提供；11kDa 由北京祥瑞生物制品有限公司提供；TB-PPD 标准品(50 IU ／ mL)由中国食品药品检定研究院结核病疫苗和过敏原产品室制备。

1.4 动物分组及致敏 将豚鼠随机分为Mtb 致敏组(12 只)和 BCG 致敏组(6 只)。Mtb 致敏组每只豚鼠经大腿腹股沟皮下注射2 mg ／ mL H37Ra 活菌菌液0.5 mL。BCG 致敏组每只豚鼠经大腿腹股沟皮下注射 2 mg ／ mL BCG 菌液 0.5 mL。

1.5 皮试试验 所有豚鼠致敏5 周后进行皮试试验。Mtb 致敏组分为 2 个亚组(6 只 ／ 亚组),由 2 人分别独立完成皮试,BCG 致敏组由1 人完成皮试。皮试时,取重组EC 和11kDa 蛋白,分别稀释至10、5、2.5 μg ／ mL,以轮圈法在豚鼠背部两侧拔毛后,皮内注射,0.1 mL ／ 只；同时注射 TB-PPD 标准品,0.1 mL ／ 只,作为阳性对照。皮试 24 和 48 h 后,盲法观察和记录局部硬结的纵径及横径,并求其平均值(纵径和横径相加除以2),判定标准为平均红晕或硬结反应直径 ＜5 mm 为阴性,≥ 5 mm 为阳性,≥ 10 mm 为强阳性。

1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 7 软件进行统计学分析,相同浓度的EC 和11kDa 的皮试反应大小比较采用配对t 检验,24 和48 h 皮试反应大小比较采用二元方差分析后的Sidak′s 多重比较检验,以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EC 和11kDa 对Mtb 致敏豚鼠的皮试反应 24和48 h 的观察结果比对显示,PPD 对所有豚鼠的皮试试验均为强阳性,表明豚鼠致敏成功。

24 h 皮试反应结果显示,0.25、0.5 和 1 μg 剂量下的EC 和11kDa 的皮试反应均为强阳性,且同剂量下两者的反应大小均接近,差异均无统计学意义(第 1 次试验:t 分别为 1.305、0.790 6 和 0.291 1,P 均 ＞ 0.05；第 2 次试验:t 分别为 0.307 1、0.176 2和1.168,P 均 ＞0.05)。表明2 种制剂对Mtb 致敏豚鼠的检测效果相当；同时,以EC 和11kDa 剂量的自然对数值(ln 值)对反应大小累计值建立线性回归,在 0.25 ～ 1 μg 剂量范围内,EC 和 11kDa 的皮肤反应大小均呈明显的剂量反应关系。见图1 和图2。

48 h 皮试反应结果显示,0.25、0.5 和 1 μg 剂量的EC 和11kDa 的皮肤反应均为强阳性,且同剂量下两者的反应大小差异均无统计学意义(第1 次试验:t 分别为 0.265 4、0.840 7 和 0.121 1,P 均 ＞0.05；第 2 次试验:t 分别为 1.085、0.395 3 和 0.933 7,P 均 ＞ 0.05),见图 3。

与24 h 比较,48 h 的皮试反应大小略有下降,其中 0.25 μg 剂量 EC 以及 0.25、0.5 和 1 μg 剂量11kDa 的24 和48 h 皮试反应大小差异均有统计学意义(分 t 分别为 4.457、5.526、3.565 和 2.987,P均 ＜0.05),见图4。

2.2 EC 和11kDa 对BCG 致敏豚鼠的皮试反应比较 PPD 对所有BCG 致敏豚鼠均呈现强阳性反应,24 和48 h 的平均皮试反应大小分别为(17 ± 2)和(15 ± 2)mm,而不同剂量的 EC 和 11kDa 在 24 和48 h 的皮试反应均为阴性。表明2 种制剂对BCG致敏豚鼠也具有相同的反应性。

图1 Mtb 致敏豚鼠24 h 皮试反应大小Fig.1 Skin test reaction 24 h after injection in Mtb-sensitized guinea pigs

图2 线性回归图Fig.2 Linear regression of skin test reaction

图3 Mtb 致敏豚鼠48 h 皮试反应Fig.3 Skin test reaction 48 h after injection in Mtb-sensitized guinea pigs

图4 Mtb 致敏豚鼠48 h 与24 h 皮试反应的比较Fig.4 Skin test reactions 48 and 24 h after injection in Mtb-sensitized guinea pigs

3 讨 论

Mtb 复合群特有的RD 区在卡介菌和大部分非结核分枝杆菌中均缺失,为结核病诊断新技术和结核新疫苗的发展奠定了基础。目前,利用RD-1 区相关抗原,如 ESAT6、CFP10、MPT64、TB7.7 等,开发的IGRA 技术已成功应用于结核病诊断和潜伏感染人群筛查［10-11］。与IGRA 相比,新型皮内诊断制剂,采用传统PPD 的皮试方法,具有更高的性价比,近年发展迅速。本实验室先后研发了重组11kDa 和EC 2种Mtb 感染鉴别抗原,用于解决PPD 无法区分Mtb 感染和BCG 接种的问题,在临床前动物模型上均获得良好的验证［8,12-13］。本研究中,对不同剂量的11kDa和EC 进行了平行比较并探讨其剂量效应关系。

11kDa 作为第一代鉴别抗原,仅以RD-1 区ESAT6抗原为基础进行构建；之后发展的第二代鉴别抗原EC,为ESAT6 和CFP10 串联表达的融合蛋白。临床研究发现,结核病患者PBMC 对ESAT6 或者CFP10抗原的应答程度不一,部分患者仅对其中一种抗原响应强［14-15］。因此,联合2 种抗原可提高检测的灵敏度,同时并不降低特异度。不过在本研究中,尽管EC 较11kDa 增加了抗原CFP10,但对Mtb 感染的豚鼠,两者皮肤反应均呈强阳性,且大小没有显著差异,与早期研究一致［12］。表明在动物模型上未观察到抗原种类多样性带来的实质益处,提示动物过高的攻毒剂量与人自然状态下的机会感染不一样,反映了动物感染模型难以完全模拟人的感染状态。

通过对 0.25、0.5、1 μg 梯度剂量的皮试结果分析,尤其是24 h 的结果,表明EC 和11kDa 的皮试反应具有明显的剂量效应关系,即皮试剂量越大,皮试反应越强。同时,考虑低剂量(0.25 μg)的皮试反应也呈强阳性,提示需进一步研究更宽剂量范围内的线性相关性,并为临床研究安全性的剂量爬坡设定提供参考。此外,48 h 皮试反应大小均小于24 h,部分剂量呈显著差异。实际上,除了大小的变化,48 h 反应的红晕较24 h 颜色更淡,表明其反应已处于衰退期。因此,与PPD 动物皮试常以48 h 观察结果为主不同,EC 和11kDa 诱导的皮肤反应可能以24 h 结果判定为宜。此外,EC 和11kDa 诱导的皮肤反应以红晕为主,偶见硬结,这与PPD 主要诱导产生硬结也不相同,提示其迟发型超敏反应的机理可能存在差异。

除了在Mtb 感染豚鼠上EC 和11kDa 表现出相近的检测效果,对BCG 致敏的豚鼠,两者也具有相同的反应性——不会诱发迟发型超敏反应。而PPD对BCG 致敏豚鼠呈强阳性反应。表明动物模型上,EC 和11kDa 在对Mtb 感染和BCG 接种的鉴别诊断具有相一致的检测效能,相比传统的PPD,优势明显。而EC 较11kDa 增加抗原后是否能获得更高的灵敏度,仍需通过临床试验验证。