肠道病毒71 型全病毒灭活疫苗(C4 亚型)的交叉中和特性

刘佩，卞莲莲，霍雅倩，陈磊，刘思远，毛群颖，吴星，高帆，梁争论

1.中国食品药品检定研究院,北京102629；2.北京民海生物科技有限公司,北京102629

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种常见于5 岁以下婴幼儿的传染性疾病［1］,少数患儿可并发病毒性脑炎、脑干脑炎、肺水肿和急性弛缓性麻痹等重症,甚至导致死亡［2］。肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是导致重症HFMD 的主要病原体,90%以上的HFMD 死亡病例由EV71 所致［3］。EV71 仅有1 个血清型,按VP1 核苷酸序列差异可分为A、B 和C 3 个基因型,其中B 和C 基因型可进一步分为 B0［4］、B1 ～ B5 和 C1 ～ C5［5］共 11 个基因亚型。EV71 在全球均有流行,研究显示,自2005年后,亚太地区主要流行株为不同的B 和C 亚型,我国大陆主要流行株为C4 亚型［6］。目前,临床尚无针对EV71 感染的特异性治疗药物,注射疫苗成为控制EV71 引起HFMD 的主要手段。

目前研发的EV71 疫苗均由单一基因亚型疫苗株制备(如 B3,B4 和 C4 亚型)［7-10］。2015 — 2016 年,中国大陆地区3 家企业研发的EV71 全病毒灭活疫苗(C4 亚型)相继获批上市［10］,至今已批签发约4 640 万人份。我国EV71 疫苗对全球范围流行的其他基因型或亚型的交叉中和能力是该疫苗走向国际市场的基础,成为人们关注的焦点［11］。本实验室前期研究表明,C4 亚型疫苗对 B4、B5、C2、C4 和 C5 株具有良好的交叉中和能力［6,12］。为进一步了解该疫苗的交叉保护特性,本研究采用 B0 ～ B4、C1、C2、C4 和C5 株病毒检测免疫EV71 全病毒灭活疫苗(C4 亚型)婴幼儿临床血清样本的中和效价,以期为EV71 疫苗应用于其他EV71 流行国家和地区的疫情防控提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 血清样本 选择2018 年江苏省5 岁以下婴幼儿免疫 EV71 全病毒灭活疫苗(C4 亚型)后,C4 亚型中和抗体为阳性(免疫前为阴性)的血清样本,共46 份。

1.2 细胞及病毒 人横纹肌肉瘤(rhabdomyoma,RD)细胞及 C4 亚型 EV71 毒株(EV71 标准病毒株［13］)由中国食品药品检定研究院保存；B0 ～B4、C1、C2和C5 亚型EV71 毒株由英国国家生物制品检定所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)提供。毒株信息见表1。

表1 EV71 毒株相关信息Tab.1 Information of EV71 strains

1.3 主要试剂 MEM 培养基(货号:05900)购自日本日水制药株式会社；胎牛血清(货号:10099-141C)及胰蛋白酶(货号:25200-072)均购自美国Gibco 公司；青-链霉素(货号:CPS101.02)及L-谷氨酰胺(货号:25030-081)购自澳大利亚Cellmax 公司。

1.4 细胞培养 将 RD 细胞悬液按 1 ∶3 ～ 1 ∶6 的传代比例进行传代培养,用10%完全培养基于37 ℃,5%CO2细胞培养箱培养,待细胞生长至致密单层时,用于后续试验。

1.5 EV71 中和抗体的检测 采用微量细胞病变法。将血清样本按1 ∶8 稀释,56 ℃灭活30 min；以稀释后的待测血清作为起始浓度,在96 孔板中进行2 倍系列稀释至 1 ∶16 384；将 B0 ～ B4、C1、C2、C4 和 C5 亚型EV71 加入 96 孔板,100 TCID50／ 孔,37 ℃中和 2 h；加入 RD 细胞悬液,(1 ～ 1.5)× 105个 ／(mL·孔),轻拍混匀,35 ℃培养7 d。于倒置显微镜下观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),以抑制50%细胞病变的血清最高稀释度的倒数为血清中和效价,血清中和效价≥8 判为阳性,＜8 判为阴性(按4 计数,参与计算),计算几何平均滴度(geometric mean titers,GMTs)及其增长倍数(fold increases in geometric mean titers,GMFIs),并评价 B0 ～ B4、C1、C2、C5 亚型与 C4亚型检测结果的相关性(R2)。

2 结 果

2.1 血清样本各基因亚型EV71 中和抗体的水平各血清样本不同基因亚型EV71 抗体的阳转率均为100%；中和抗体GMTs 范围为288.9 ～871.3,GMFIs为72.2 ～217.8,不同亚型间GMTs 和GMFIs 的倍数差均在3倍以内。见表2。

表2 不同基因亚型EV71 抗体的检测结果Tab.2 Determination results of antibodies in EV71 vaccine of various subgenotypes

2.2 各亚型EV71 与C4 亚型标准毒株中和抗体检测结果的相关性 B0 ～ B4、C1、C2 和 C5 亚型 EV71与C4 亚型标准毒株中和抗体结果均呈良好相关性,R2分别为 0.652 8、0.618 4、0.639 1、0.719 5、0.689 1、0.669 3、0.726 4 和 0.697 4,见图 1。

图1 不同亚型EV71 毒株与C4 亚型标准毒株中和抗体水平的相关性Fig.1 Relationship of neutralizing antibody levels against EV71 strains of various subgenotypes to that of standard straim of subgenotype C4

3 讨 论

EV71 为RNA 病毒,其3D 聚合酶属于低保真度的RNA 依赖性RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP),缺乏校对修复相关活性［14］,因此其基因组突变率较高,EV71 与其他肠道病毒(enterovirus,EV)基因组的突变和重组易导致新的流行株出现。A 基因型(BrCr 株)于1970 年在美国加利福尼亚州首次成功分离；B0 基因型出现于60 年代,并与 A 基因型一起流行［4］。1997 年前,欧美HFMD 主要呈 B1、B2、C1 和 C2 亚型的小范围流行；1997 年后,亚太地区发生多起HFMD 暴发,呈B3 ～ B5 及 C3 ～ C5 等多种基因型 EV71 流行态势［15-25］,中国流行株为C4 亚型毒株。2008 年起,C4基因亚型EV71 引起的HFMD 在国内开始流行［26］。

2015 年12 月,中国研发的EV71 全病毒灭活疫苗(C4 亚型)获批上市,对 C4 亚型 EV71 所致 HFMD保护率达 90%以上［27-29］。JIANG 等［30］通过检测阴性设计法评估2017 年1 月1 日 — 2018 年 12 月 31日EV71 全病毒灭活疫苗(C4 亚型)在广西12 岁以下儿童重症HFMD 病例中的有效性,结果表明,接种1 针和2 针疫苗的儿童校正疫苗有效性分别为81.4%和88.3%。WANG 等［31］采用同样方法对北京2 184例5 岁以下HFMD 病例开展研究,结果显示,对于重症病例,2 针免疫后疫苗有效性为100%；对于轻症病例,1 针和2 针校正疫苗有效性分别为 69.8%和83.7%。上述结果表明,EV71 全病毒灭活疫苗(C4 亚型)具有良好的保护效果。EV71 疫苗对不同亚型毒株的交叉保护能力是影响疫苗免疫效果的关键要素,2016 年中国食品药品检定研究院颁布的《EV71 疫苗质量控制和评价技术要点》［32］和2020 年WHO 颁布的《WHO 灭活疫苗EV71 疫苗规程》均明确指出,非临床和临床评价应重点关注疫苗对不同毒株的交叉保护能力［33］。

不同亚型毒株制备的EV71 全病毒灭活疫苗具有不同的交叉中和能力。CHOU 等［34］对B4 亚型疫苗Ⅰ期临床血清与 B1、B4、B5、C2、C4a 和 C4b 株进行交叉中和研究,结果显示,免疫血清对B1、B5 和C4a 具有较强的中和作用,对C4b 中和能力较弱,对C2 无交叉中和作用,提示该疫苗对C2 株可能不易发生交叉中和。本实验结果显示,EV71 全病毒灭活疫苗(C4 亚型)免疫血清对 B0 ～ B4、C1、C2、C4 和C5 9 个亚型毒株均具有较好的中和活性,且B0 ～B4、C1、C2 和C5 毒株中和效价检测结果与C4 具有良好的相关性。

综上所述,我国生产的EV71 全病毒灭活疫苗(C4 亚型)对其他国家或地区流行的B 和C 基因亚型的EV71 毒株均具有良好的交叉中和能力,本实验为我国生产的EV71 疫苗在其他国家或地区的应用提供了实验依据。