丹酚酸B改善糖尿病血糖波动模型大鼠心肌损伤的作用*

赵梦秋 任尤楠 陶善珺 郑书国

1. 安徽卫生健康职业学院药学教研室，安徽 池州 247009；2. 皖南医学院药理学教研室，安徽 芜湖 241002

糖尿病心肌病(DCM)是一类以心肌细胞肥大、凋亡以及间质纤维化为表现的心肌特异性疾病，随着糖尿病病程的延长可逐渐进展为心力衰竭。作为糖尿病的主要并发症，DCM这一概念自1974年首次提出以来，一直受到学者持续关注。DCM 发病机制复杂，涉及心肌代谢紊乱、氧化应激、钙超载等多种反应[1]，近年来越来越多的基础及临床证据表明炎症在DCM发生发展中发挥重要作用[2,3]。

丹酚酸B(salvianolicacid B，Sal B)是从治疗心血管系统疾病的传统中药丹参中提取的活性成分，其抗炎及心血管保护作用已在多项基础研究中证实[4-7]。但丹酚酸B是否能通过减轻心肌组织炎症状态改善DCM，目前未见报道。为了观察丹酚酸B对DCM的影响，本研究采用高糖高脂饮食合并腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立大鼠糖尿病模型，并在此基础上错时给予胰岛素或葡萄糖建立更符合临床特点的糖尿病血糖波动模型，观察丹酚酸B 对糖尿病大鼠心肌损伤的作用，为临床应用丹酚酸B 防治糖尿病心肌病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物与饲料 健康雄性SD 大鼠，体重220～240 g，由浙江省实验动物中心提供，许可证号SCXK(浙)2014-0001；高糖高脂饲料(含猪油10%、蔗糖10%、蛋黄粉5%、胆固醇1%、普通饲料74%)，由南京市青龙山实验动物中心提供。

1.1.2主要药物与试剂 丹酚酸B(80%)，西安文竹生物科技有限公司；STZ，美国Sigma 公司；普通胰岛素，江苏万邦生化医药股份有限公司；核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)一抗、核转录因子-κB(NF-κB)p65亚基一抗、β-actin 一抗、Histone H3一抗，abcam公司；预染蛋白Marker(5～245 KDa)，GeneDire公司；0.45 μm PVDF膜，Millipore公司；二抗、蛋白定量试剂盒，代轩生物；白介素1β(IL-1β)检测试剂盒、白介素6(IL-6)检测试剂盒、白介素18(IL-18)检测试剂盒、心肌天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)检测试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，苏州卡尔文生物科技有限公司；总抗氧化能力(TAC)检测试剂盒，南京建成生物；其余试剂均为分析纯。

1.1.3主要仪器 血糖仪、血糖试纸，长沙三诺生物传感技术有限公司；酶标仪，北京普朗集团；微型高速离心机，杭州奥盛仪器有限公司；双垂直电泳仪，北京六一仪器厂；全功能化学发光及荧光生物图像分析系统，上海复日科技有限公司；显微镜，日本尼康。

1.2 方法

1.2.1糖尿病大鼠血糖波动模型制备[8]与给药 SD大鼠适应性喂养1周后，随机选取10只作为正常组，喂以普通饲料，其余大鼠给予高糖高脂饲料。4周后，禁食12 h，按40 mg/kg一次性腹腔注射STZ。7天血糖基本稳定后以随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型制备成功。将糖尿病大鼠随机分为模型组、丹酚酸B 高剂量(SG)组及丹酚酸B 低剂量(SD)组。模型组和丹酚酸B 治疗组继续喂饲高脂饲料，于每日8:00及18:00检测血糖值，并根据血糖水平，选择皮下注射普通胰岛素6～9 u(随机血糖≥16.7 mmol/L)或灌胃给予葡萄糖2 g/kg(随机血糖<16.7 mmol/L)，造成1日内血糖水平大幅度波动模型。丹酚酸B治疗组同时灌胃给予丹酚酸B 160 mg/kg和80 mg/kg，连续6 周。

1.2.2大鼠空腹血糖及血糖波动水平检测[9]实验结束前1日检测各组大鼠8:00、12:00、16:00、18:00 和20:00血糖值。20:00后禁食，12 h后测大鼠空腹血糖。用血糖日平均水平、日平均血糖的标准差和最大血糖波动幅度评价各组血糖稳定性。

1.2.3心肌组织病理学观察 实验结束时大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，腹主动脉取血，收集心肌组织样本。心肌组织多聚甲醛固定、常规石蜡包埋、切片，HE 染色观察病理学改变。

1.2.4血生化指标检测 腹主动脉取血后分离血清，按试剂盒说明书检测血清LDH、IL-6水平。

1.2.5心肌组织生化指标检测 心肌组织制备10%组织匀浆，按试剂盒说明书测定IL-1β、IL-18、TAC、Caspase-1，BCA法测定蛋白浓度。

1.2.6心肌组织NF-κB活化、NLRP3蛋白表达水平检测 心肌组织使用RIPA 裂解液或细胞核蛋白抽提试剂盒，提取总蛋白或核蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白，转膜、封闭后依次加入一抗及二抗。ECL化学发光法显色，全功能发光仪器检测曝光，分析光密度值。以与内参光密度的比值作为蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠1日内血糖变化

正常组大鼠血糖低且平稳；模型组大鼠血糖在8:00处于较高水平，皮下注射胰岛素后血糖持续降低，10:00后因药物代谢及自由进食，血糖持续升高，于18:00注射胰岛素后血糖再度下降；丹酚酸B 治疗组血糖波动趋势基本和模型组一致，提示糖尿病大鼠血糖波动模型建立成功。 图1、表1所示为治疗结束前1日各组大鼠血糖波动情况。

表1 各组大鼠1日内血糖变化

图1 各组大鼠1日内血糖变化

2.2 丹酚酸B对大鼠血糖的影响

与正常组比较，模型组大鼠空腹血糖及最大血糖波动幅度明显升高(P<0.01或P<0.05)，表明糖尿病血糖波动模型造模成功。与模型组相比，丹酚酸B治疗组大鼠空腹血糖明显降低(P<0.01或P<0.05)，但血糖波动情况仍然存在。具体见表2。

表2 丹酚酸B对大鼠血糖的影响

2.3 丹酚酸B对糖尿病大鼠心肌组织病理改变的影响

糖尿病大鼠心肌细胞排列稍紊乱，出现核固缩、核碎裂的现象，部分细胞核增大、淡染，提示糖尿病血糖波动模型大鼠出现了心肌细胞损伤。丹酚酸B治疗组大鼠心肌损伤明显减轻。见图2。

A.正常组；B.模型组；C.丹酚酸B低剂量组；D.丹酚酸B高剂量组。

2.4 丹酚酸B对糖尿病大鼠炎症因子、LDH水平的影响

与正常组相比，模型组大鼠LDH及炎症因子IL-6、IL-1β、IL-18水平均明显升高(P<0.01)，丹酚酸B治疗组上述指标均明显改善(P<0.01)，见表3。

表3 丹酚酸B对大鼠炎症因子、LDH水平的影响

2.5 丹酚酸B对糖尿病大鼠心肌组织Caspase-1水平的影响

表4显示正常组大鼠心肌组织Caspase-1水平处于极低状态，而模型组大鼠Caspase-1明显升高(P<0.01)，丹酚酸B 治疗组大鼠Caspase-1相比于模型组明显降低(P<0.01)。

表4 丹酚酸B 对大鼠心肌组织Caspase-1水平的影响

2.6 丹酚酸B对糖尿病大鼠心肌组织NF-κB活化、NLRP3蛋白表达水平的影响

与正常组相比，模型组大鼠心肌组织NF-κB核表达、NLRP3蛋白表达水平均明显升高(P<0.01或P<0.05)，丹酚酸B治疗后NF-κB活化、NLRP3蛋白表达减少(P<0.01或P<0.05)，见图3。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.7 丹酚酸B对糖尿病大鼠心肌组织抗氧化能力的影响

由表5可见模型组大鼠心肌组织TAC比正常组大鼠明显降低(P<0.01)，丹酚酸B 治疗组大鼠TAC相比于模型组明显升高(P<0.01)，表明丹酚酸B 治疗提高了大鼠心肌组织的抗氧化能力。

表5 丹酚酸B 对大鼠心肌组织抗氧化能力的影响

3 讨 论

糖尿病及其并发症是危害人类健康的常见疾病。2018年Diabetologia公布的中国最新糖尿病流行病学数据显示，我国糖尿病患病率已接近 11%，患者总数位居全球第一[10]，而患者对血糖的控制意识往往并不强[11]。在降糖治疗过程中，由于饮食、药物及治疗依从性等多方面因素的影响，患者常常难以有效控制血糖波动[12]。而糖尿病并发症及预后除与血糖水平有关，还与血糖波动性密切相关，血糖波动幅度越大，糖尿病并发症越严重，预后越差[13-14]。因此，积极防治血糖波动造成的组织损伤成为防治糖尿病并发症的可行措施之一。本研究通过对糖尿病大鼠错时给予胰岛素或葡萄糖建立更符合临床特征的糖尿病血糖波动模型。研究结果显示，糖尿病大鼠通过错时给予胰岛素或葡萄糖后，1天内平均血糖、平均血糖标准差及最大血糖波动幅度均明显升高(P<0.01)，表明糖尿病血糖波动模型建立成功。HE染色的结果显示模型组大鼠心肌排列稍紊乱，出现核固缩、碎裂、增大、淡染的现象，同时血清LDH水平明显升高，提示糖尿病血糖波动模型大鼠出现心肌组织损伤，而丹酚酸B治疗组大鼠的心肌损伤明显减轻，说明丹酚酸B可有效改善糖尿病血糖波动模型大鼠心肌损伤。

炎症是参与糖尿病心肌病发生发展的主要因素之一，炎症小体作为炎症活化的一种重要形式，在炎症组织损伤过程中发挥关键作用。NLRP3炎症小体是一类分布于细胞浆中的蛋白复合体，能感受细胞内多种免疫相关信号刺激，参与细胞功能调控。文献报道[15-16]NLRP3炎症小体参与包括糖尿病在内的多种疾病的发展，有学者认为NLRP3炎症小体可作为糖尿病心肌病的分子标志物[17]。NLRP3炎症小体由NLRP3、ASC和Caspase-1组成。NLRP3激活后与ASC结合，诱导pro-Caspase-1进行自我剪切生成活化的Caspase-1。活化的Caspase-1将pro-IL-1β及pro-IL-18剪切成具有活性的IL-1β、IL-18，从而激活炎症反应，引起组织细胞损伤[18]。NLRP3的产生依赖于NF-κB通路[2]。当细胞接受相关刺激信号后，抑制 NF-κB的蛋白激酶被降解，NF-κB转移至细胞核，上调 NLRP3、pro-IL1β、pro-IL-18、IL-6等表达。高糖和高脂介导的活性氧(ROS)在这一过程中占主要作用。糖脂刺激心肌细胞内ROS过度产生，ROS促使细胞内DNA、蛋白等多种成分发生氧化修饰，同时还介导NLRP3炎症小体的聚集和活化[19]。

本实验结果显示糖尿病血糖波动大鼠心肌组织抗氧化能力明显降低，NF-κB核表达、NLRP3蛋白表达增加，Caspase-1、IL-1β、IL-18活性升高，同时血清炎症因子IL-6水平升高，以上结果与文献报道基本一致。丹酚酸B治疗组大鼠上述指标均有明显改善，这一结果与其减轻心肌损伤、减少LDH释放作用相符，提示丹酚酸B减轻心肌损伤与抑制炎症反应有关。

综上所述，丹酚酸B具有改善波动高糖引起的心肌细胞损伤的作用，机制可能与其提高心肌组织抗氧化能力、抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1通路，改善心肌炎症状态有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突