荧光定量PCR技术在食品快速检测中的应用

丁博群，刘珊娜

（天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300392）

随着生活水平的提高，人们对食品的质量安全关注度逐渐增强。传统的食品检测方法耗时较长，无法满足市场的需求，发展食品快速检测技术成为必然趋势。快速检测是指实验样品前处理简单、所用试剂较少、制备后可较长时间保存、操作简便、对操作人员要求较低且能够在较短时间内完成检测分析并得出结果的检测方法[1]。此方法可以快速筛查存在问题的产品，及时避免生产企业的损失和食品安全事件的发生。目前常用到的快速检测技术有化学比色法、酶抑制法、免疫分析技术、分子生物学技术、生物芯片技术、生物传感器技术等[1]。本文分析了以分子生物学为基础的荧光定量聚合酶链式反应（realtime quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技术在食品快速检测中的研究现状和应用热点，为完善食品快速检测体系提供参考。

1 荧光定量PCR的基本原理及发展历程

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）又称为PCR技术，是一种在生物体外把少量初始样品中的目的基因DNA片段进行大量扩增的核酸合成技术。荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技术是在PCR过程中引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，产物不断增加，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环收集到一个荧光强度信号，根据荧光强度的变化来监测产物量的变化从而得到一条荧光扩增曲线，实现对起始模板定量及定性分析[2-3]。扩增曲线一般分为停滞期、指数增长期和饱和期，由于只有指数增长期的扩增曲线是存在线性关系的，所以选择在这一时期进行分析[4]。与常规PCR相比，荧光定量PCR采用光谱检测，避免了耗时的凝胶电泳，更加快速便捷，提高了检测的准确性、灵敏性和特异性[5]。1992年荧光定量PCR技术被首次报道[6]，随后，SYBR Green染料、Eva Green染料、TaqMan探针、分子信标等均出现在荧光定量PCR的应用中。1999年Vaïtilingom等[7]通过荧光定量PCR技术测定食品中的转基因玉米和大豆，这是荧光定量PCR首次报道应用于食品检测中。二十一世纪以来，荧光定量PCR技术逐渐开始应用于检测食品中致病菌、掺杂掺假、过敏原、寄生虫、抗性基因、可食用昆虫等。近年来，又出现了将荧光定量PCR技术与其他技术相结合的检测手段，比如采用免疫磁分离与qPCR结合的方法快速检测大肠杆菌[8]；采用叠氮溴化丙锭（PMA）与qPCR联合的方法检测生菜中的沙门氏菌[9]；基于GNM C7-8 qPCR系统对8种食源性致病菌进行检测分析[10]；利用芯片与qPCR结合的技术鉴别羊肉掺杂掺假[11]；将微生物分子检测仪与qPCR结合对食品中沙门氏菌进行检测[12]；建立了荧光定量PCR技术与微滴数字PCR技术结合的检测方法用于精确定量肉制品中的羊肉成分[13]。除此之外还有一些在试剂盒上的改进，比如王斌[14]研发了一种带有无需电路结构和额外照明光源即可发出与荧光试剂相同荧光色并达到指示效果的自发光指示灯管，使荧光定量PCR技术可以在更多样的环境下应用，操作更加便利。

2 荧光定量PCR的分类

2.1 荧光染料法

常用的荧光染料包括SYBR GreenⅠ、Eva Green和Pico Green等，其中SYBR GreenⅠ应用最为广泛[15]。SYBR GreenⅠ不结合单链的DNA，游离状态下不受激发，无信号检测，能选择性地与双链DNA结合产生强烈的荧光，其信号强度与体系中的双链DNA含量成正比。SYBR GreenⅠ的最大优势在于可用于监测双链DNA序列的扩增，对DNA模板没有选择性，通用性强，使用方便，不需要设计和合成复杂的探针，灵敏度高，价格便宜。但是SYBR GreenⅠ会与体系中非特异性的双链DNA结合产生假阳性的信号，影响实验结果的准确性[16]。

2.2 荧光探针法

荧光探针法分为水解探针和杂交探针两种。TaqMan探针是最常见也是应用最广泛的水解探针，可以与互补靶序列进行特异性结合。其5’端标记报告荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团，3’端的荧光淬灭基团可以吸收5’端的报告荧光基团所发射的荧光能量，检测不到报告荧光基团的信号；而在PCR延伸时，热稳定DNA聚合酶5’端→3’端的核酸外切酶活性将荧光探针降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，就可以检测到报告基团的荧光[17-18]。TaqMan探针检测的是累积荧光，它的强度与PCR产物的扩增量有关。TaqMan探针的优势在于特异性高，引物设计相对简单，重复性好；局限性表现在只适合特定的目标，荧光探针不能自行标记，合成价格较高。杂交探针中应用最多的是分子信标[4]。分子信标是一个呈发夹结构的闭合环状双标记寡核苷酸探针，两端分别标记报告荧光基团和荧光淬灭基团，初始阶段两端的碱基互补配对，称为茎状区，目的基因扩增时，茎状区在加热条件下解链由环状变为链状，目的基因与原来的环状区特异性结合，报告荧光基团被激发释放荧光[4,19-20]。

3 荧光定量PCR技术在食品检测中的应用领域

3.1 食源性致病菌的检测

目前，荧光定量PCR技术在食源性致病菌的检测方面应用广泛，相对其他方面较为成熟，已有在多种类型食品中检测不同致病菌的研究报道。表1总结了近年来部分研究情况，其中TaqMan探针法使用相对较多。

3.1.1 肉制品中食源性致病菌的检测 肉制品中蛋白质和脂类等营养物质含量丰富，存在化学性污染和生物性污染等风险。肉制品中常见的食源性致病菌主要包括沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭状芽孢杆菌、志贺氏菌等。杨旭[31]使用免疫磁分离与两重荧光定量PCR相结合的快速检测方法对鲜猪肉中金黄色葡萄球菌和志贺氏菌进行检测分析，检测可在6 h内完成，金黄色葡萄球菌的检测限为2.52CFU/g，志贺氏菌的检测限为1.36 CFU/g。杨滴等[37]采用荧光定量PCR技术的TaqMan探针法对肉制品中蜡样芽胞杆菌进行分析检测，最低检出限为1 ×103CFU/mL，同时具有较高的特异性和灵敏度。王远洋等[40]对酿脓链球菌进行荧光定量PCR检测分析，为食品中酿脓链球菌的检测提供了灵敏度高、特异性强、高效便捷的参考方法。

3.1.2 水产品中食源性致病菌的检测 水产品的食品安全性常常会因粪便或生活废水等污染而受到影响，除此之外，在加工、贮藏、运输、销售等各个环节的操作不当或卫生要求不达标，水产品也有可能会被致病菌污染。吴孟娟[41]利用免疫磁珠捕获与荧光定量PCR联合技术建立对水产品中河弧菌的快速检测方法。Miotto等[27]建立了用PMA与荧光定量PCR联合的方法检测牡蛎中存活的大肠杆菌。

表1 荧光定量PCR在食源性致病菌检测中的应用情况Table 1 Application of real-time qPCR in the detection of food-borne pathogens

3.1.3 乳制品中食源性致病菌的检测 乳制品营养丰富并且容易被人体消化吸收，因此也存在被致病菌污染风险[42]。不仅养殖环境、母体本身会对乳制品中的致病菌数量产生影响，在工人挤奶操作和生产加工的过程中灭菌是否彻底以及储运销售过程中交叉污染等均会对乳制品的食品安全性造成影响。Demirci等[30]应用荧光定量PCR技术对来自48头奶牛、65只山羊、65只绵羊和53头驴的231份生乳样品中的沙门氏菌和志贺氏菌进行了研究。林碧莲等[32]建立了多重实时荧光定量PCR快速检测婴幼儿奶粉中的沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌的方法，姚笛等[34]利用荧光定量PCR检测方法对牛乳中的沙门氏菌进行检测。郭梦冉等[36]建立了荧光定量PCR对乳制品中金黄色葡萄球菌检测的方法，通过实验验证检出限为3.5 CFU/mL，并且可以快速检测乳制品中的金黄色葡萄球菌。

3.1.4 即食食品中食源性致病菌的检测 即食食品容易在加工或贮藏运输的过程中被致病菌侵染从而威胁到消费者的身体健康，其中单增李斯特菌的侵染非常普遍。据调查结果显示，我国即食食品被单增李斯特菌侵染的比率为1%～6%[43]。鲜切果蔬作为即食食品更容易被致病菌污染，鲜切果蔬中常见的食源性致病菌包括大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏杆菌属等[44]。关棣锴等[22]对超市中售卖的鲜切伊丽莎白甜瓜中的单增李斯特菌进行荧光定量PCR检测，其检出限为6.28×102CFU/mL。叶欣[45]对即食肉制品和果蔬中的金黄色葡萄球菌进行荧光定量PCR检测，避免了细胞培养的过程，大大提高了检测速度和效率。郭蔷等[46]建立了一种可以快速检测蔬菜中沙门氏菌的荧光定量PCR的方法，检出限为18 CFU/mL，准确率高达90%，应用该方法对从农贸市场获取的60份新鲜蔬菜样品进行检测，结果表明其中5份样品含有沙门氏菌，检出率为8.33%。

标准培养方法、常规PCR和荧光定量PCR在食源性致病菌检测中的应用比较见表2。标准培养检测方法需要划线培养、染色镜检、平板计数等，步骤繁琐，耗时较长，但是操作简单，成本低，不需要特殊仪器，也不需要专门培训专业技术人员。常规PCR比标准培养检测方法速度更快，灵敏度更高，需要PCR仪和凝胶电泳，成本较高，速度较快，但是提取DNA时无法判断菌体是否死亡，还有可能提取的过程中会被抑制PCR进程的物质污染，或者发生提取不完全等情况，均可能对检测结果造成误差。荧光定量PCR比常规PCR更敏感、更准确，并且反应环境相对封闭，减少了被污染的可能性，不需要凝胶电泳，操作步骤相对较少，检测时间短、速度快，但是需要培训专业技术人员，而且荧光定量PCR仪和探针价格较贵，检测成本高。

3.2 食品掺杂掺假的检测

3.2.1 肉制品中掺杂掺假的检测 近年来有学者应用荧光定量PCR技术对肉制品的掺杂掺假作了研究。Chen等[50]在线粒体细胞色素b基因片段中设计了物种特异性引物和探针，建立了定量检测肉制品中牛源性成分的荧光定量PCR方法，结果表明该引物和探针对肉制品中的牛源性成分具有特异性，绝对检出限为0.025 ng DNA，阳性样品相对检出限为0.002%（w/w），该方法在实际应用中具有良好的稳定性、特异性和敏感性。Tan等[51]建立了一种优化的DNA提取方法与SYBR Green染料荧光定量PCR结合的检测试剂盒，用于快速检测肉制品中的猪源性成分，在DNA混合物中检出限为10 fg猪源性DNA和0.001%（w/w）猪源性DNA，该方法可以在1.5 h内完成检测，而且与探针法相比成本低4倍。Kim等[52]用线粒体细胞色素b基因设计了驴源性特异性引物和探针，建立了荧光定量PCR检测不同肉制品中驴源性成分的方法，检测限为0.001 ng DNA，在生、煮、烤、烘干、研磨、油炸和高压灭菌的肉制品中的检测限为0.001%。Li等[53]提出了一种基于参考引物的荧光定量PCR方法，用于定量测定山羊肉中掺杂的猪源性成分，对不同比例的猪和山羊肉混合物进行检测，结果显示该方法的准确度较高、耗时短、操作简便。

表2 标准培养方法、常规PCR与荧光定量PCR比较Table 2 Comparison of standard culture method, conventional PCR and real-time qPCR

3.2.2 乳制品中掺杂掺假的检测 马奶酒（酸马奶）传统上是由马乳自发发酵而成，生产者和交易者存在将马制品与牛制品掺假的可能性。Guo等[54]建立了基于物种特异性的TaqMan探针三重荧光定量PCR的方法，用于鉴定牛乳和乳制品中的牛源性物质和马源性物质，同时扩增了内源性对照，以消除假阴性的可能，该方法检测牛乳、酸牛乳和马乳检出限为0.001 ng，酸汤和马奶酒检出限为0.005 ng，此外，使用不同源性乳品混合物有效验证了该方法良好的特异性、敏感性和可重复性。Domenico等[55]开发了一种TaqMan探针的荧光定量PCR快速测定方法，可用于乳制品中的物种鉴定，该方法被证明对牛、绵羊、水牛和山羊源性物质具有敏感性、快速性和特异性。

3.2.3 饮料中掺杂掺假的检测 蓝莓、树莓、蔓越莓等小浆果不仅口感好、能量低而且含有丰富的有益健康的生物活性物质，因此受到广大消费者的青睐。Yang等[56]建立了一种基于TaqMan探针的荧光定量PCR方法，用于鉴别小浆果产品中蔓越莓、覆盆子和蓝莓的原料成分，并对经过巴氏杀菌以及高温高压处理的小浆果产品进行了测试，验证了其适用性。将该方法用于对小浆果产品掺杂掺假的检测，可确定小浆果产品的真实性，避免消费者受欺诈，同时预防食物过敏。

咖啡粉和速溶咖啡中常常会有掺入各种价格便宜谷物的情况，如烤大麦、玉米、大豆等，因此，需要对磨碎的咖啡豆和速溶咖啡进行掺杂掺假的鉴别。Ferreira等[57]开发了一种基于荧光定量PCR的方法，用于检测商用磨碎和速溶咖啡中的谷物，对大麦、玉米和大米源性物质的检出限分别为0.6、14和16 pg。通过对不同国家地区的30个咖啡商品进行检测，验证了该方法的适用性。

3.2.4 其他食品中掺杂掺假的检测 藏红花是印度、西班牙、法国等地区常用的一种调味料，其生产和收获的成本很高。Villa等[58]提出了基于Eva Green染料的荧光定量PCR方法检测藏红花中掺杂的红花，检测限为2 pg的红花DNA。

冬虫夏草被描述为草药“虫草”中药用成分的唯一来源，而蛹虫草和天牛两种真菌是食品成分的真菌来源。这三种植物的相互替代和掺杂掺假，严重影响了食品的安全性，降低了草药的治疗效果。Moon等[59]建立了一种荧光定量PCR检测鉴别食品和草药中真正的虫草和掺假物种掺假程度的方法。

3.3 转基因食品的检测

转基因食品是指可以直接食用的转基因生物或者采用转基因生物加工而成的食品，是最早应用荧光定量PCR技术进行检测的一个食品领域。1999年，荧光定量PCR技术首次应用于食品中转基因玉米和大豆的检测，为日后该技术在转基因食品检测中的应用提供了参考[7]。王凤军等[60]采用多重荧光定量PCR对转基因大豆及其加工产品进行检测，该方法可同时检测内源基因和外源基因，提高了效率，降低了成本，实现了一管多检，为转基因大豆及其制品提供了便捷高效的检测方法。权永兵等[61]采用荧光定量PCR分别对5种不同方法提取的大米Bt63转基因成分进行检测。王洪健等[62]建立了荧光定量PCR检测蛋白粉中转基因成分的方法。邵彪等[63]以启动子、终止子和标记基因特异性序列为检测目标，对肉制品中添加的植源性转基因成分进行多重荧光定量PCR检测，解决了DNA在加工过程中遭到破坏而产生假阴性的问题，同时使检测更加方便快捷。

3.4 食品中过敏原的检测

食品中的八大过敏原包括乳品、蛋类、花生、小麦、大豆、坚果、鱼类和甲壳类，近年来，采用荧光定量PCR对多种过敏原进行了检测（表3）。Guan等[64]用基于TaqMan探针的荧光定量PCR技术对牛奶中过敏原α-乳清蛋白进行分析检测，检测限为0.05 ng，可以在3 h内完成DNA的提取和检测，与依赖于蛋白质检测的方法相比，该技术具有更大的热稳定性和更强的分析加工食品的能力，并且更便宜、快捷和灵敏。Linacero等[65]在过敏原编码序列上设计新型引物，利用荧光定量PCR方法检测食品中的核桃过敏原，检测限为2.5 pg核桃DNA，与ELISA分析比较，该方法在核桃的痕量检测中显示出更高的灵敏度和可靠性。

表3 荧光定量PCR在过敏原检测中的应用Table 3 Application of real-time qPCR in the detection of allergens

3.5 食源性寄生虫的检测

环孢子虫是一种原生动物寄生虫，食用被其卵囊污染的新鲜果蔬产品或水会引起人类腹泻病。Murphy等[78]开发了一种优化的TaqMan探针荧光定量PCR测定法，并通过该方法和巢式PCR分别对香菜和覆盆子进行检测，两种方法经过对比表明，荧光定量PCR工作量较小，操作简单快捷，不易受扩增产物的污染，并且可以对扩增和结果进行实时监控分析。Temesgen等[79]开发并评估了一种新颖的多重荧光定量PCR，用于同时检测浆果中的多房棘球绦虫、刚地弓形虫和环孢子虫，该检测方法不但可以分析浆果水果，也可以很好地用于其他类型的新鲜农产品的检测。Frey等[80]建立了一种荧光定量PCR与熔解曲线分析相结合的新型检测技术用于分离、检测和区分叶类蔬菜和浆果中的绦虫虫卵，可用于监测含有绦虫的产品污染情况，以评估消费者的潜在风险。

3.6 可食用昆虫的检测

食用昆虫的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质元素等含量丰富，具有营养价值高的优点，但不是所有昆虫都是安全可食用的。Kim等[81]开发了基于TaqMan探针的荧光定量PCR快速检测方法，可在40 min内完成对食品中可食用稻蝗的检测，绝对检出限为0.5 pg稻蝗DNA，在经过处理的昆虫混合物中检出限为0.1%，该方法是一种高度特异、灵敏且快速的方法，为鉴别可食用稻蝗和加工食品中的稻蝗源性成分提供了参考。可食用蚕常常会被加工成粉末状，为了避免与其他昆虫混淆，Kim等[82]使用TaqMan探针的荧光定量PCR方法检测可食用家蚕，检测限为0.001 ng蚕DNA，为向消费者提供准确的食品标签信息提供了方法。

昆虫是目前的新兴食品来源，其可能携带对人类的身体健康存在一定风险的抗生素耐药基因，在食品安全方面尚需对其抗生素耐药性进行定量评估。Vandeweyer等[83]对荧光定量PCR进行了优化，用以检测和量化食用昆虫中的抗生素抗性基因tet（O，K，M，S）和erm（B），并利用该技术检测不同生产和饲养批次的30个新鲜昆虫样品，结果表明，粉虫比蟋蟀样品平均含有更多的tet（K）、tet（M）和tet（S）基因，仅在蟋蟀样品中存在tet（O）基因，一个粉虫样品中还检测到erm（B）基因。Milanović等[84]用荧光定量PCR技术对即食蝗虫和粉虫中的5种碳青霉烯抗 性 基 因（blaNDM-1、blaVIM、blaGES、blaOXA-48、blaKPC）进行了定量分析，结果表明，粉虫样本中没有检出blaGES、blaKPC和blaVIM基因，蝗虫样本中没有检测到blaGES和blaKPC基因，但blaOXA-48在样本中普遍存在。

4 结论与展望

近年来，随着科技的发展和检测的需要，荧光定量PCR技术在很多领域的检测方面具有很重要的作用和意义。荧光定量PCR技术属于分子生物学检测技术中的一种，凭借高自动化、被污染率小、灵敏、高效、快捷等特点，在快速检测食品的致病菌、掺杂掺假、转基因、过敏原等方面已取得大量的研究进展。然而荧光定量PCR技术还存在一些不足，比如：a.设备成本高；b.检测所需的引物和探针价格较高；c.需要培训专业技术人员来操作；d.样品中可能存在抑制PCR进程的物质；e.某些染料可能会与体系中非特异性DNA结合。但是荧光定量PCR技术在快速检测领域仍具有很大优势。与酶联免疫法相比，其在痕量检测时具有更高的灵敏度和可靠性，而且外部环境对酶联免疫检测有一定影响，还有发生交叉反应的可能；与生物传感器相比，生物传感器虽然操作简单易于携带，但是检测成本高，抗体的纯化和修饰也比较困难；环介导等温扩增反应灵敏、专一、步骤少，可减少样品损耗，但是对实验的环境条件要求很高，容易产生假阳性；与依赖于蛋白质检测的方法相比，荧光定量PCR具有更大的热稳定性和更强的分析加工食品的能力。

荧光定量PCR技术在食品快速检测领域发展迅速，将其与其他技术相结合是目前一大发展方向，比如：a.PMA与荧光定量PCR相结合，适量的PMA可以抑制死细胞DNA扩增，从而避免提取到死细胞的DNA而造成的假阳性；b.免疫磁珠法与荧光定量PCR相结合，免疫磁珠可以高特异性富集目标菌，从而提高检测的效率和准确性；c.芯片与荧光定量PCR相结合，简化实验操作，使检测时间更短[11]；d.自动化检测体系与荧光定量PCR相结合，减少实验员操作，避免检测过程中的微生物污染[12]。未来可在现有研究基础上，优化设计引物和探针的操作、降低检测成本，扩大使用范围，解决导致检测结果假阳性的问题。此外，开发便于携带和操作的试剂盒产品，使检测不仅限于实验室中，而可以随时随地进行，提高检测的时效性和便利性，使荧光定量PCR技术拥有更大发展空间。