碱蓬草总生物碱提取工艺优化及其对高脂饮食小鼠的体内抗氧化活性

李小阳，韩冠英 ，闫 松，赵艳丹，郭 斌，崔 錾

（1.锦州医科大学，辽宁锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院，辽宁锦州 121000）

碱蓬（Suaeda salsa）是藜科植物，为一年生叶肉质化真盐生草本植物[1-2]，营养丰富，是优质蔬菜和油料作物。碱蓬的嫩茎叶既可鲜食，又可干制，宋人曾巩在《隆平集西夏传》中有古人食用碱蓬的记载，因此碱蓬具有食用开发前景。碱蓬中含有丰富的生物碱、黄酮、蛋白质、酚醌、多糖类等化合物[3-5]，此外碱蓬草总生物碱具有药用价值，可以降糖、降压、防治心脏病、增强人体免疫力等[6]。碱蓬籽生产出的“共轭亚油酸”，具有抗癌[7]、降胆固醇、抗动脉粥样硬化等[8]功效。

生物碱是主要存在于植物中的一类含氮的碱性有机化合物，具有镇痛、抗炎、抗菌等[9-11]药理活性。有研究发现生物碱还具有杀虫活性及抗氧化作用[12-14]。目前尚未见对碱蓬草中生物碱提取工艺及体外抗氧化活性进行研究的相关报道。

普遍采用超声波辅助法、醇溶剂提取法、水或酸水等提取方法来提取植物中的生物碱[15-16]。虽然水或酸水法提取生物碱简单经济，但提取液浓缩困难，而且耗时较长；醇类极性较大，穿透力强、溶出率高、沸点较低、容易回收[17]。超声波辅助法可缩短提取时间，提高提取效率，应用广泛，不受分子质量大小、成分极性的限制，适用于绝大多数有效成分的提取[18]。本实验采用乙醇作为溶剂，联合超声波辅助法，既可以达到理想的提取效果，又可以保证被提取物作为药用与食用的安全性。

本实验采用乙醇作为提取剂，在单因素实验的基础上，采用正交设计法研究碱蓬草中总生物碱的最佳提取工艺，并对其抗氧化活性进行了研究，以期为碱蓬草日后在食品及医药行业的研究应用提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碱蓬草 采自辽宁省锦州市沿海滩涂湿地，经锦州医科大学药学院郭斌教授鉴定为碱蓬属碱蓬草（Suaeda salsa）；无水乙醇、三氯化铁、双氧水（H2O2）、硫酸亚铁（FeSO4）、二氯甲烷 天津永晟精细化工有限公司；氢氧化钠 天津市永大化学试剂有限公司；碘化铋钾 天津市光复精细化工研究所；硅钨酸 天津市科密欧化学试剂有限公司；胆固醇 安徽天启化工科技有限公司；猪油 自备；蛋黄粉 天津市永大化学制剂有限公司；胆酸钠 上海如吉生物有限公司；基础饲料 实验室自制；丙二醛MDA试剂盒、过氧化氢酶CAT试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他试剂 均为国产分析纯；SPF鼠 锦州医科大学（许可证号：SCXK（辽）2017-0003）。

SHZ-D（111）恒温水浴锅 上海腾方公司；BP 211D型电子分析天平 德国Sartorius公司；RE-3000A旋转蒸发仪 上海广英公司；UP3200HE数控超声波清洗器 南京垒君达超声电子设备有限公司；PHSJ-4A实验室pH计 上海精密科学仪器有限公司；UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津；UP3200HE数控超声仪 南京垒君达超声电子设备有限公司；80-1离心机 常州天隧仪器有限公司；SCD-118TMPA冰箱 海尔股份公司；DH-360（303-1）恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；680型全自动酶标仪 美国Bio-Rad公司；WH-3微型涡轮混合仪 上海精科实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 碱蓬草总生物碱的提取工艺 将新采得的碱蓬草放置阴暗处晒干，粉碎机打粉后60目过筛备用。分别称取碱蓬草粉5 g，按照一定料液比加入一定浓度的乙醇溶剂，在一定的温度、一定时间下进行超声处理。超声后抽真空过滤，滤液旋干后加入25 mL 1% HCl超声1 min后加入2 mol/L NaOH约3 mL将pH调至10～11，过滤后滤液加入35 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液于40 ℃旋转蒸发仪旋干，用2 mL乙醇将碱蓬草总生物碱溶解，乙醇自然蒸发后得橘黄色至黄褐色固体，即为碱蓬草总生物碱。

1.2.2 鉴别反应

1.2.2.1 碘化铋钾反应 取碘化铋钾2 g，加冰醋酸20 mL后加50 mL蒸馏水稀释。取1 mL碱蓬草总生物碱溶液于试管中，加1～2滴碘化铋钾试剂，观察是否产生沉淀及沉淀颜色[19]。

1.2.2.2 碘-碘化钾反应 取碘0.5 g与碘化钾1.5 g，加蒸馏水25 mL蒸馏水稀释。取1 mL母液于试管中，加2～3滴碘化钾试剂。观察是否产生沉淀及沉淀颜色[19]。

1.2.2.3 硅钨酸反应 取硅钨酸10 g加蒸馏水稀释至100 mL，取1 mL母液于试管中，加1～2滴硅钨酸试剂。观察是否产生沉淀及沉淀颜色[19]。

1.2.2.4 碘化汞钾反应 取碘化钾10 g，加水10 mL溶解后，缓缓加入二氯化汞的饱和水溶液，随加随搅拌，至生成的红色沉淀不再溶解加蒸馏水稀释至200 mL。取1 mL母液于试管中，加2～3滴碘化汞钾试剂。观察是否产生沉淀及沉淀颜色[19]。

1.2.3 碱蓬草总生物碱提取量的测定 参考文献[20-22]的方法，采用无水乙醇为溶剂，精密配制14.28、12.50、11.11、10.00、9.09 μg/mL盐酸小檗碱标准品溶液。将得到的橘黄色至黄褐色固体定容至一定体积测出其吸光度值，利用紫外分光光度计在272 nm波长下测定溶液吸光度A值，根据吸光度值算出生物碱浓度。以盐酸小檗碱的质量浓度为横坐标，吸光度A值为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程为：y=0.05603x+0.00205，R2=0.99951。按照绘制盐酸小檗碱标准曲线的方法，测定碱蓬草总生物碱的吸光度A值，根据式1得出碱蓬草总生物碱的提取量。

式中：C为根据盐酸小檗碱标准曲线计算出碱蓬草总生物碱的质量浓度（μg/mL）；V为碱蓬草总生物碱定容后的体积（mL）；M为实验用碱蓬草粉的质量（g）。

1.2.4 碱蓬草总生物碱单因素实验 以碱蓬草总生物碱提取量为指标，分别考察超声时间、超声温度、乙醇浓度、料液比4个因素对碱蓬草总生物碱提取量的影响。在每个因素中，设定5个水平进行单因素试验，每组实验重复三次，取平均值。

1.2.4.1 不同超声时间对碱蓬草总生物碱提取量的影响 固定料液比为1:10（g/mL），超声温度为40 ℃，乙醇浓度为75%，采用1.2.1的方法提取碱蓬草总生物碱，评价不同的超声时间（10、15、20、25、30 min）对碱蓬草总生物碱提取量的影响。

1.2.4.2 不同超声温度对碱蓬草总生物碱提取量的影响 固定超声时间为25 min，乙醇浓度为75%，料液比为1:10（g/mL），采用1.2.1的方法提取碱蓬草总生物碱，评价不同的超声温度（25、30、35、40、45 ℃）对碱蓬草总生物碱提取量的影响。

1.2.4.3 不同乙醇浓度对碱蓬草总生物碱提取量的影响 固定料液比为1:10（g/mL），超声时间25 min，超声温度为40 ℃，采用1.2.1的方法提取碱蓬草总生物碱，评价不同的浓度的溶剂（55%、65%、75%、85%、95%）对碱蓬草总生物碱提取量的影响。

1.2.4.4 不同料液比对碱蓬草总生物碱提取量的影响固定超声时间为25 min，超声温度为40 ℃，乙醇浓度为75%，采用1.2.1的方法提取碱蓬草总生物碱，评价不同的料液比（1:8、1:10、1:12、1:14、1:16 g/mL）对碱蓬草总生物碱提取量的影响。

1.2.5 碱蓬草总生物碱的正交试验 根据单因素实验结果采用超声时间、超声温度、乙醇浓度、料液比为考察因素，每个因素选定三个水平，设计L9（34）正交试验以确定碱蓬草总生物碱的最优提取工艺。因素水平见表1。

表1 正交试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 碱蓬草总生物碱抗氧化活性的测定

1.2.6.1 实验分组和处理 将100只4周龄昆明SPF鼠（雌雄各半，体重20±2 g），随机分为5组（碱蓬草总生物碱低、中、高剂量组，高脂对照组，正常对照组）每组20只，5只一笼。正常组给予小鼠基础饲料，高脂组对照组给予高脂饲料，碱蓬草总生物碱低、中、高剂量组给予高脂饲料。将实验室制得的碱蓬草总生物碱与蒸馏水根据小鼠体重（取20 g）配制成2、4、8 mg/kg，并对小鼠进行灌胃，试验期间小鼠行自由饮水和摄食，每天上午9点进行灌胃，连续4、8、12、16周。控制饲养室的温湿度控制在22～25 ℃；40%～60%。

按照高脂饲料配方[23]的比例实验室自制高脂饮食。胆固醇含量为1%；猪油含量为10%；蛋黄粉含量为10%；胆酸钠含量为0.1%；基础饲料含量为78.9%。

将实验小鼠禁食不禁水12 h，用20%乌拉坦溶液0.1 mL/20 g将小鼠腹部内注射进行麻醉，腹主动脉取血置于含有肝素钠的真空取血管中。静置30 min，3500 r/min后离心15 min，分离血清之后置于-80 ℃处保存。腹部取血完成后，摘取小鼠肝脏立即放入4 ℃生理盐水中进行清洗，用滤纸吸干表面的水分。称取备用的肝脏0.2 g，加入4 ℃的生理盐水1.8 mL制成10%的肝匀浆，置于离心机中3500 r/min后离心15 min。取上清液（肝匀浆上清液），保存于-80 ℃备用。

1.2.6.2 MDA含量的测定 取10%的肝匀浆适量，按照试剂盒要求进行操作，3500 r/min，离心15 min，取上清液，按照丙二醛（MDA）试剂盒说明书行测定。

1.2.6.3 CAT含量的测定 取10%的肝匀浆适量，3500 r/min，离心15 min，取上清液，按照过氧化氢酶（CAT）试剂盒明书进行测定。

1.2.6.4 GSH-Px含量的测定 取10%的肝匀浆适量，3500 r/min，离心15 min，取上清液1 mL进行显色反应，按照谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）试剂盒要求进行操作。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 生物碱鉴别反应结果

通过表2可以看出，在碘-碘化钾反应实验中产生褐色沉淀；碘化铋钾反应实验中产生红棕色沉淀；硅钨酸反应实验中产生黄色沉淀；碘化汞钾反应实验中产生白色沉淀。以上实验均可证明被检测物中含有总生物碱[19]。

表2 生物碱鉴别反应Table 2 Alkaloid identification reaction

2.2 单因素实验结果

2.2.1 超声时间对碱蓬草总生物碱提取量的影响 根据图1可以看出，碱蓬草总生物碱的提取量随着超声时间的增长，提取量也随之增长，在超声时间为25 min时，碱蓬草总生物碱的最高提取量为0.58 mg/g。继续增加超声时间，总生物碱提取量变化平稳稍有下降，可能是在一定提取时间下随着超声时间增加，一些生物碱被破坏[24]。故选择超声时间为25 min。

图1 超声时间对总生物碱提取量的影响Fig.1 Effects of ultrasonic time on the yield of total alkaloids

2.2.2 超声温度对碱蓬草总生物碱提取量的影响 根据图2可以看出，碱蓬草总生物碱的提取量随着超声温度的升高，提取量也随之升高，当温度升高至40 ℃时，提取量出现最大值。超声温度继续升高时，碱蓬草总生物碱提取量有所下降，产生这种情况的原因可能是随着超声温度升高，一些杂质析出影响了生物碱的提取[25]。故选择超声温度为40 ℃。

2.2.3 乙醇浓度对碱蓬草总生物碱提取量的影响 根据图3可以看出，随着乙醇浓度的升高，碱蓬草总生物碱提取量也随之升高。当乙醇浓度为75%时，碱蓬草总生物碱提取量为0.58 mg/g。随着乙醇浓度的继续增加总生物碱提取量下降至平稳，这可能是由于乙醇浓度继续增加时一些挥发油或糖类等极性较低的物质被提取出来，从而影响了生物碱溶出，降低生物碱的提取量[26]，故选择乙醇浓度为75%。

图2 超声温度对总生物碱提取量的影响Fig.2 Effects of ultrasonic temperature on the yield of alkaloid

图3 乙醇浓度对总生物碱提取量的影响Fig.3 Effects of ethanol concentration on the yield of alkaloid

2.2.4 料液比对碱蓬草总生物碱提取量的影响 根据图4可以看出随着提取溶剂量的增加，碱蓬草总生物碱的提取量随之增加。固定乙醇浓度为75%，当料液比为1:10时，总生物碱提取量为0.56 mg/g。继续增加料液比，碱蓬草总生物碱提取量有所下降。可能是随着溶剂体积的增大导致对碱蓬草的超声不充分[27]，故选择液料比为1:10。

图4 料液比对碱蓬草总生物碱提取量的影响Fig.4 Effects of the ratio of material to liquid on the yield of alkaloids

2.3 正交设计试验及结果

由表3可知，极差（R）值的大小反映了实验因素对考察指标的影响程度。R值越大，表示实验因素对碱蓬草总生物碱的提取量影响越大。在碱蓬草总生物碱提取工艺实验中，对总生物碱提取量的影响因素依次为：料液比＞超声温度＞乙醇浓度＞超声时间。可见，超声温度对碱蓬草总生物碱的提取量影响最大，超声时间对碱蓬草总生物碱的影响最小。碱蓬草总生物碱的最佳提取工艺为A1B3C3D2，即超声时间为20 min、超声温度45 ℃、乙醇浓度85%、料液比（g/mL）为1:10。

表3 正交设计试验及结果Table 3 Orthogonal test design and results

由表4可知，料液比与超声温度对碱蓬草总生物碱的提取量具有显著性影响（P＜0.05），超声时间和乙醇浓度对碱蓬草总生物碱的提取量影响不大。

2.4 验证试验

按照1.2.1的方法进行验证试验，碱蓬草总生物碱平均提取量为0.65 mg/g，结果高于正交试验其它组合结果，表明该提取工艺稳定可行。

2.5 碱蓬草总生物碱抗氧化活性实验结果

2.5.1 碱蓬草总生物碱对小鼠体重的影响 在高脂饮食饲养小鼠4周时，体重出现显著性差异（P＜0.05），高脂饮食组小鼠体重超过正常组小鼠体重约8%，高脂饮食饲养小鼠16周时小鼠体重出现极显著差异（P＜0.01），高脂饮食组小鼠体重超过正常组小鼠体重约20%。

表4 正交试验方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test

2.5.2 碱蓬草总生物碱对小鼠肝脏中MDA含量的影响 从表6中可知，小鼠的肝脏正常组MDA值含量在2.15～2.70 U/mg Prot的范围内变化。正常对照组MDA含量到12周时出现峰值，之后基本处于稳定状态，可能是随着小鼠的年龄增长其抗氧化能力也随之减弱。高脂对照组的小鼠，随着饲养时间的增加，其肝脏中的MDA含量与正常组有显著差异（P＜0.05）。与正常对照组及高脂饮食对照组比较，碱蓬草总生物碱的低、中、高剂量组均可以降低小鼠肝脏中MDA的含量（P＜0.05），且除高脂饮食组外其余组MDA值均在试剂盒说明书的参考范围内。

表5 喂养高脂饮食小鼠的体重变化（g）Table 5 Body weight changes of mice fed high-fat diet (g)

表6 碱蓬草总生物碱对高脂饮食小鼠肝脏MDA含量的影响（U/mg Prot）Table 6 Effects of total alkaloids of Suaeda salsa on MDA content in liver of mice fed with high-fat diet(U/ Mg prot)

2.5.3 碱蓬草总生物碱对小鼠肝脏中CAT含量的测定从表7中可知，正常组小鼠的肝脏CAT值含量在12.44～16.68 U/mg Prot的范围内变化。CAT是生物防御体系当中重要的末端氧化酶，其主要是清除体内的过氧化氢，从而对机体有害物质羟基自由的形成[28]。高脂对照组的小鼠，随着饲养时间的增加，其肝脏中的CAT含量与正常组比较显著降低（P＜0.05）。与正常对照组及高脂饮食对照组比较，碱蓬草总生物碱的低、中、高剂量组均可以增加小鼠肝脏中CAT的含量，并且出现了剂量效应的关系（P＜0.05）。通过分析表7可知，碱蓬草总生物碱对减少高脂饮食小鼠的肝脏中CAT含量有效，随着饲养时间的增加，小鼠肝脏中的CAT含量也随之增加。

表7 碱蓬草总生物碱对高脂饮食小鼠肝脏CAT含量的影响Table 7 Effects of total alkaloids of Suaeda salsa on cat content in liver of mice fed with high-fat diet

表8 碱蓬草总生物碱对高脂饮食小鼠肝脏GSH-Px含量的影响Table 8 Effects of total alkaloids of Suaeda salsa on GSH-Px content in liver of mice fed with high-fat diet

2.5.4 碱蓬草总生物碱对小鼠肝脏中GSH-Px含量的测定 GSH-Px是一种非常重要的催化氧化酶，广泛分布在细胞内，不仅能够清除体内的自由基，还能保护细胞膜的功能与结构不被破坏[29-30]。由表8可知，正常组小鼠肝脏中GSH-Px指标随着饲养时间的延长GSH-Px值也随之增加，高脂对照组与正常对照组比较GSH-Px显著降低（P＜0.05），可知高脂饮食对小鼠的活性可以造成影响。饲喂高、中、低3个剂量的碱蓬草总生物碱与正常组及高脂对照组相比，随着饲养时间的增加，肝脏中的GSH-Px值显著性增加（P＜0.05），高剂量组效果最好。说明碱蓬草总生物碱能够提高小鼠肝脏中GSH-Px的活性。

3 结论

碱蓬草总生物碱的最佳提取工艺为：超声时间20 min、超声温度45 ℃、乙醇浓度85%、料液比1:10（g/mL），在此条件下，碱蓬草总生物碱的提取量为0.65 mg/g。抗氧化活性实验表明，碱蓬草总生物碱通过显著减少小鼠肝脏中MDA含量，增大小鼠肝脏中CAT及GSH-Px的活性(P＜0.05)，进而达到了抗氧化的目的，抗氧化的效果随着碱蓬草总生物碱剂量的增大而增加。本实验为进一步开发与利用碱蓬草资源提供了一定的理论依据，可作为碱蓬草食品方向的研究基础。