香萱益神方对血管性痴呆模型大鼠神经元凋亡机制研究

李 欧，张 洁，徐 建

(1.上海市中医医院神志病科，上海 200071；2.上海市中医医院中医睡眠疾病研究所，上海 200071 )

血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是指由一系列的脑血管病因素(主要为高血压病、高血脂症、糖尿病等)、显性因素(脑梗死、脑出血等)或非显性脑血管病(脑白质疏松、慢性脑缺血等)引起的临床表现为认知功能障碍的痴呆综合征[1]。据报道，截止2015年全球每3 s就发现1例新的阿尔兹海默病(Alzheimer dementia，AD)患者，目前全球阿尔兹海默病患者约4600万人，预计2050年，全球患病人数将达到1.51亿[2]。有调查显示，VD患者至少占AD病例总数的10%～20%[3]。流行病学显示，我国VD患病率高达1.1%～3.0%，VD已经成为仅次于AD 的第二大老年性痴呆疾病，严重威胁着老年人的身心健康[4]。VD不仅在认知功能上出现明显障碍，并且对患者的日常生活质量、社会价值、个人自理能力均有较大程度的影响。目前虽然VD的病因及发病机制尚无统一定论，但VD在有效手段干预后，疾病的发生发展有一定的可逆性，因此VD的预防及治疗工作具有十分重要的意义[5]。中医药对于延缓VD的发生发展具有一定优势，本课题组在前期临床研究中发现中药经验方香萱益神方可以有效改善VD患者的认知功能，本次实验研究则着重探讨该方对VD大鼠神经元凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：Wistar大鼠健康雄性45只，动物质量合格证(2015000541616)；许可证号[SCXK(沪)2012-0002]；平均体重(200±15)g，均由上海市斯莱克实验动物责任有限公司提供，上海市中医医院实验中心动物房SPF级饲养。适应性饲养2周后进行实验。实验期间保证实验动物自由进食喂养，饲养环境安静，保证饲养温度控制在(24±2)℃、湿度40%～50%，光照节律12L/12D 、光照时间6:00～18:00。

1.1.2 主要试剂：注射用生理盐水购自广东大冢制药有限公司，水合氯醛购自上海国药试剂集团，香萱益神方的中药草药由上海市中医医院中药房提供。大鼠血清及海马组织脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)采用酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定，试剂盒(批号 EK0308)、TTC染色试剂盒均由武汉博士德生物有限公司提供。DAB显色液(批号PW017，武汉博士德生物有限公司)；试剂Trizol(批号15596-016，Invitrogen公司)；试剂Tween-20(批号1247-CAS，Sigma生物技术有限公司)。

1.1.3 主要仪器：手术器械(上海圆创生物有限公司)、1号手术缝线(美国强生医疗器材有限公司)、医用电子天平(凯丰生物有限公司)、电泳仪(型号DYCZ-24DN)、脱色摇床(型号SLK-OR3000)、Real-time检测仪、干式恒温器(型号JXH-200)、旋涡振荡器(型号Vortex XW-80A)、生物组织包埋机(型号KD-BM)、电热恒温室水槽(型号SSW-420-2S)、 Morris 水迷宫视频分析系统(成都泰盟科技有限公司，型号MT-200)。

1.2 实验方法

1.2.1 香萱益神方：香附、石菖蒲、焦山栀、远志各9 g，萱草花20 g，肉桂、砂仁各3 g。

1.2.2 建模、分组及给药：适应性喂养2周，Morris水迷宫排除特异性大鼠后，运用随机数字表法将大鼠随机分为三组：假手术组、模型组、中药组。模型组、中药组采用改良-两血管结扎法建立VD大鼠模型。大鼠术前12 h禁食，不禁水，以10%水合氯醛腹腔麻醉后，取大鼠仰卧位，将其固定于鼠板上；剃毛器于颈部范围剃毛备皮、常规75%酒精消毒，颈部正中剪刀切出1 cm切口，钝性分离皮下组织，于气管旁找到左侧颈总动脉，玻璃分针小心分离迷走神经，使用4号手术线于颈动脉上下分别结扎，术中动作轻柔、尽量避免牵拉神经、避免金属器械损伤神经，结扎后缝合。术后伤口处喷撒少量青霉素注射液，防止感染，电热毯保持体温。直至大鼠苏醒，将其移动至鼠笼。1周后行右侧颈动脉结扎，手术方法同前。假手术组：大鼠同上步骤进行固定、麻醉、取颈部正中部位切口，仅分离双侧颈总动脉，不进行结扎术。中药组给予香萱益神方，中药液按照16 g/kg剂量灌胃。其余两组予等剂量的纯净水灌胃。三组均连续灌胃6周。

1.2.3 行为学检测:造模结束1周后采用 Morris 水迷宫学习记忆行为测试[6]评估大鼠的学习记忆能力。Morris水迷宫实验分为两部分:①定位航行试验：先将大鼠放入水池中(不放平台)自由游泳，让其熟悉Morris 水迷宫环境。训练开始时，将平台置于NW象限，将受试大鼠头朝池壁按顺时针方向依次由第一象限、第二象限、第三象限、第四象限入水点，放入水中。如果大鼠在2 min内找到平台(逃避潜伏期)，记录2 min内实际逃避潜伏期时间;如果在2 min内未找到平台，将其引上平台并停留10 s，逃避潜伏期时间记录为2 min。每天于固定时间段训练，4 次/ d，120 s/次，持续 4 d。每天取4次逃避潜伏期时间的平均值作为当日成绩。②空间探索试验：Morris水迷宫实验的第5天撤除原平台，同时将所有大鼠于原本平台所在象限的对侧象限入水点，放入水中，观察并记录大鼠2 min内穿越原平台区域的次数、在目标象限停留时间。每次实验结束后，毛巾擦干及吹干大鼠后放入笼内。

1.2.4 TTC染色检测梗死面积：大鼠取脑后，全脑置于-20 ℃冰箱中速冻20 min后，切片。第一刀于脑前极与视交叉连线中点处，第二刀于视交叉部位，第三刀于漏斗柄部位，第四刀于漏斗柄与后叶尾极之间[7]。将切片置于2%浓度TTC染液中。锡箔纸盖住容器后，室温平衡15～30 min，取出切片拍照。

1.2.5 BDNF检测：大鼠水迷宫最后1天检测后，麻醉处死，腹腔主动脉取血后、于碎冰上及时分离出Wistar大鼠脑组织，分离海马部分后迅速置于液氮中冷却后研磨制备匀浆。海马组织磁力悬浮器充分研磨后，3000 r/min、离心5 min后取悬浮物。全血3000 r/min、离心10 min后分离血清，严格按照试剂盒说明操作，Elisa法检测大鼠海马及外周血血清BDNF含量，Western blot法检测BDNF蛋白水平。

1.2.6 大鼠海马组织形态及神经元凋亡率：HE观察大鼠海马组织形态，Tunel染色法观察大鼠神经元凋亡率。

2 结 果

2.1 各组大鼠术后1周Morris水迷宫实验结果 各组大鼠定位航行实验结果见表1。假手术组大鼠随着实验天数的增加，8～11 d寻找到平台的时间不断缩短，组内比较差异有统计学意义(均P<0.05)，说明大鼠的空间学习能力不断提高。模型组大鼠随着实验天数的增加，寻找到平台的时间并无改善，组内比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。术后9 d、术后10 d、术后11 d，模型组与假手术组大鼠找到平台的时间比较，差异有统计学意义(均P<0.05)；假手术组、中药组各时间点找到平台的时间比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 各组大鼠术后1周定位航行实验结果(s)

各组大鼠空间搜索实验结果见表2。Morris水迷宫术后11 d结果显示，模型组大鼠与假手术组相比，在目的象限滞留时间、运动距离、进入目的象限次数与总象限的百分比均高于模型组(P<0.05)。中药组与模型组大鼠相比，各指标结果差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠术后1周空间搜索实验结果

2.2 各组大鼠治疗6周Morris水迷宫实验结果 定位航行实验结果见表3。假手术组大鼠随着实验天数的推移，找到平台时间不断缩短。模型组大鼠找到平台时间虽有缩短，但各时间点的观察时间仍长于假手术组，组间比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。中药组与模型组比较，各时间点时间明显缩短，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表3 各组大鼠治疗6周定位航行实验结果(s)

空间搜索实验结果见表4。模型组大鼠逃逸平台进入次数、第3象限滞留时间、第3象限运动距离、第3象限进入次数均低于假手术组，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，中药组大鼠逃逸平台进入次数、第3象限滞留时间、第3象限运动距离、第3象限进入次数均高，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。

表4 各组大鼠治疗6周后Morries水迷宫空间搜索实验结果

2.3 各组大鼠脑梗死面积比较 大鼠脑组织 TTC 染色后的梗死灶会呈苍白色，而未梗死组织可被染成玫瑰红色，白色与红色之间界限清晰。假手术组无明显脑梗死组织；模型组脑内多为白色组织，可见少量玫瑰红色组织，说明模型组大鼠脑内出现脑梗死；中药组与模型组比较，脑内白色面积明显减少，说明VD模型大鼠脑内梗死面积较正常大鼠增多，而在香萱益神方治疗后大鼠脑组织得到改善，见图1。

图1 各组大鼠TTC染色结果

2.4 各组大鼠外周血清、海马组织BDNF含量比较 模型组与假手术组比较，外周血血清、海马组织中BDNF含量均不同程度下降，组间差异有统计学意义(F=4.726，P<0.05)。中药组与模型组比较，中药组血清中BDNF含量较高，差异无统计学意义(P>0.05)。中药组海马组织中BDNF含量较高，差异有统计学意义(F=17.466，P<0.05)。说明香萱益神方可以提高VD大鼠海马组织中BDNF浓度。见表5。

表5 各组大鼠血清、海马组织BDNF水平比较(pg/ml)

2.5 各组大鼠BDNF蛋白水平表达比较 BDNF蛋白灰度值的计算以 GAPDH 为内参。模型组与假手术组比较，BDNF蛋白水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后中药组BDNF蛋白表达水平与模型组比较，BDNF蛋白表达水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6(图2)。

图2 Western blot检测各组大鼠海马组织BDNF蛋白表达水平

表6 Western blot检测大鼠海马BDNF蛋白表达水平

2.6 各组大鼠海马组织HE染色结果 利用HE染色技术，进行各组大鼠脑内海马组织形态观察(图3)。假手术组海马神经元在视野中可见细胞排列比较整齐，结构清晰，形态较为完整，胞浆丰富。模型组海马组织细胞排列散乱，胞体散在呈现固缩状态，细胞核色深染，胞间隙增大，有空泡变性现象。中药组海马神经元细胞形态有所恢复，排列较为整齐，偶见少量空泡变性。

图3 各组大鼠海马组织形态图(HE染色，×400)

2.7 各组大鼠海马神经元TUNEL染色结果 经TUNEL染色后，凋亡的海马神经元染色镜下可看到深棕色颗粒，根据公式计算大鼠海马神经元凋亡率。假手术组大鼠神经元细胞深棕色染色面积较少。模型组与假手术组比较，深棕色染色细胞面积肉眼下可见增多，海马神经元凋亡率高于假手术组，差异有统计学意义(P<0.01)。中药组与模型组比较，深棕色染色细胞数目减少，海马神经元凋亡率低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表7(图4)。

表7 TUNEL法检测海马神经元凋亡率(%)

图4 各组大鼠海马神经元调亡情况(TUNEL染色，×400)

3 讨 论

中医学认为肝属木，藏血，主气机升降，调畅情志，喜条达而恶抑郁。肝通过协调气的升降出入平衡，保证气血正常运行和精神情志活动[7]。一旦气机紊乱，肝气郁结，气血运行失常，无法协助脾胃后天之本化生水谷精微则易引起情志活动异常而出现认知功能受损。此外，肾精的生长有赖于肝血的滋养，若肝气不畅，气虚则血虚，肾精不足而脑髓失养，亦会出现认知功能的失常。因此通过疏肝法治疗VD，气行则血行，瘀滞自化，认知功能得到提高，临床可取得较好的治疗疗效，同时疏肝益智也为VD中医治疗打开了新的思路。导师徐建教授在这一理论指导下创立经验方香萱益神方治疗VD，方中香附理气疏肝解郁、萱草花疏肝安神醒脑，二者共为君药发挥醒神、理气之功；石菖蒲辛温芳香，既能醒神，又可宁神益志；远志，味辛苦，性温，擅安神益智，二药相济，使气自顺而壅自开，共奏开窍明神之功；佐以肉桂芳香辛散，温通经脉，引火归元，助理气开郁，同时又可以寒热相济，阴阳平衡；砂仁辛散温通，气味芳香，可化湿浊[8]；焦山栀清热除烦，清泄中焦内热[9]，配合理气药，可疏肝泄热；全方阴阳调和，共达疏肝调气，益志开窍之效，有效改善患者认知功能。

海马神经元主要参与人体大脑内的学习、记忆。当大脑长期处于慢性缺血、低灌注时，大脑内海马体最先受损，随之海马出现乙酰胆碱水平降低、突触可塑性改变、细胞Ca2+超载、兴奋性氨基酸神经递质异常增加、炎症反应、氧自由基过氧化应激、tau蛋白过度磷酸化等应激表现，以上应激反应通过某种信号通路作用损害海马神经元功能，继而导致认知功能障碍的出现[10]。目前较明确的是海马神经元细胞凋亡是导致机体认知功能障碍的主要病理原因之一。死亡受体通路、线粒体通路、内质网应激作用是公认的、较经典的三条细胞凋亡机制通路。当海马神经元出现应激反应时，上述三条经典凋亡通路被激活，进一步诱导凋亡基因Bcl-2、Caspase基因家族、Ice基因家族等，最终导致海马神经元细胞程序性死亡，海马体参与的记忆与空间定位功能受损，机体表现为认知功能障碍的痴呆[11-12]。近年来，对BDNF-PI3k/TrkB/AKT信号通路的研究越来越热门。已知的PI3K/AKT通路具有保护细胞、调节细胞代谢、改善学习记忆能力的作用，该通路在脑内神经病变如脑梗死、帕金森病、AD、神经元病变、多发性硬化症的发病中起着重要作用[13-15]。PI3k是同时具有蛋白激酶活性、酯类激酶活性的磷脂激酶家族中的重要成员之一；PI3k有多种同工酶，这些同工酶均可使磷脂酰肌醇PI的D3羟基磷酸化，促进生成 D3-磷酸化磷酸肌醇 PIP2(PI-3,4-P2,3,4-二磷酸磷脂酰肌醇)和PIP3(PI-3,4,5-P3,3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇)[16-18]。二者可以共同激活下游一系列蛋白信号通路，其中PI3-K-AKT/PKB信号通路的转导对细胞凋亡调节作用起着关键作用，包括其对凋亡基因Bcl-2、Capsase家族基因的调节作用。当BDNF与TrkB结合后，TrkB的二聚体化进一步被诱导，激活其受体酪氨酸激酶区域的酪氨酸(Y)自动磷酸化，经典的PI3K/AKT通路能够被激活，发挥抗凋亡作用，从而抑制了VD的发生发展[19-20]。因此如何通过有效干预措施减缓海马神经元凋亡，改善机体认知功能，近年来已成为热点问题。本课题实验证实，经香萱益神方治疗6周后的VD大鼠认知能力有了明显的改善。同时，香萱益神方还具有抑制海马神经元凋亡的作用。从TTC染色结果可见，VD大鼠脑内出现大面积脑梗死，经香萱益神方治疗后中药组脑梗死面积明显少于VD组。HE染色结果示，中药组大鼠与VD大鼠相比，海马神经元细胞形态相对完整，细胞排列也较整齐，空泡数量明显减少。TUNEL染色结果示，中药组大鼠海马神经元细胞棕褐色深染面积凋亡率明显少于VD组大鼠，经过神经元凋亡率计算，中药组海马神经元凋亡率低于VD组。通过对BDNF蛋白定量及定性检测发现，中药香萱益神方可以改善模型组大鼠BNDF水平。总之，香萱益神方能改善VD模型大鼠学习记忆能力，可能与该方抑制凋亡基因的过表达、保护海马神经元细胞、延缓海马神经元细胞凋亡有关。

综上所述，在疏肝益志理论指导下运用香萱益神方治疗VD大鼠，可改善VD大鼠认知行为、抑制海马神经元凋亡，为临床治疗提供新思路与方法。