肉桂对慢性缺氧心肌细胞的保护作用研究

卢玉润，唐宇帆

(1.四川省医学科学院 四川省人民医院,四川 成都 610072;2.四川大学华西公共卫生学院 四川大学华西第四医院,四川 成都 610041)

目前，缺血性心脏病严重危害人类身体健康，其发病率日趋上升。氧气是心肌细胞维持正常功能所必需的物质。心脏依靠血液供应氧气，所以缺血引起缺氧时可造成心肌损伤、心脏功能下降等[1-2]。中药肉桂是樟科植物的干燥树皮，有补火益阳，祛寒止痛，温经通血之功效，能暖脾胃，除积冷，通血脉，可治宫寒、腹痛、腰痛、胸痹等[3-4]。研究表明，肉桂醛可以改善高糖毒性对乳鼠心肌细胞的损伤，抑制心肌成纤维细胞凋亡[5]。肉桂通过改善心肌能量代谢减轻糖尿病大鼠心肌损伤[6]。低氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)在低氧信号转导中起着重要的介导作用。血管内皮因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种促血管生长的因子。HIF-1α可通过与VEGF启动子区缺氧反应元件(Hypoxia response element，HRE)结合激活VEGF基因的表达[7-8]。

本研究通过建立心肌细胞缺氧模型，分析不同剂量肉桂作用下，心肌细胞的增殖与凋亡情况；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、硫代巴比妥酸反应产物(Thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)含量的变化；心肌损伤标志蛋白肌钙蛋白T(Cardiac troponin T，cTnT)、肌酸激脢同工酶(Creatine kinase MB，CK-MB)、肌红蛋白(Myoglobin,Myo)、HIF-1α、VEGF表达量的变化，探究肉桂对心肌细胞缺氧损伤的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞：心肌细胞H9c2购自ATCC公司。

1.1.2 主要试剂与仪器：DMEM培养液、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)购自Gibco公司；青霉素、链霉素、总蛋白提取试剂盒和PBS购自北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶购自吉诺生物制药技术有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；SOD试剂盒、MDA测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；TBARS检测试剂盒购自Abnova公司；山羊抗鼠cTnT、CK-MB、Myo、β-actin单抗以及HRP-Tag兔抗山羊购自Cell Signaling公司；兔抗大鼠VEGF、HIF-1α单抗和辣根过氧化物酶山羊抗兔购自上海康成生物技术有限公司。仪器包括BIO-RAD酶标仪(山东博科科学仪器有限公司，型号IMARK)、奥斯巴林荧光显微镜(南京贝登医疗股份有限公司，型号BX53)。

1.2 实验方法

1.2.1 肉桂：购自安国市弘发中药饮片有限公司，批号160501。称取肉桂0.5 g，加入5 ml的ddH2O，得100 mg/ml肉桂水煎液。

1.2.2 建模、分组及给药：心肌细胞H9c2用含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM培养液培养，选对数生长期细胞进行实验。根据参考文献[9]配制缺氧液：pH 6.8、37 ℃。用缺氧液替换DMEM培养液以模拟人体内缺氧环境，在高浓度饱和N2(>95%，1 L/min)下作用30 min，在密闭缺氧培养箱(94%的N2，5%的CO2，O2≤1%)中孵育6 h，构建慢性缺氧模型。

细胞随机分成五组。空白对照组：用DMEM培养液培养细胞，不加肉桂水煎液处理；缺氧组：参照上述方法，构建缺氧模型，不加肉桂水煎液处理；肉桂低剂量组：取对数生长期状态良好的细胞，加入终浓度为0.2 mg/ml的肉桂水煎液预处理细胞，然后做缺氧处理；肉桂中剂量组：取对数生长期状态良好的细胞，加入终浓度为1 mg/ml的肉桂水煎液预处理细胞，然后做缺氧处理；肉桂高剂量组：取对数生长期状态良好的细胞，加入终浓度为5 mg/ml的肉桂水煎液预处理细胞，然后做缺氧处理。各组细胞均在37 ℃孵育。

1.2.3 CCK-8法检测各组细胞增殖情况：分别收集培养0、24、48、72 h的各组细胞，按试剂盒操作进行，酶标仪检测各孔450 nm处的OD值。

1.2.4 一步法TUNEL试剂盒检测各组细胞凋亡情况：取对数生长期心肌细胞H9c2，接种于24孔板中的载玻片上(浓度为2×105个/L)，每孔500 μl，培养24 h后，按1.2.2 方法进行药剂和缺氧处理。细胞培养48 h，按试剂盒方法进行操作，在荧光显微镜(×100倍)下观察。随机选5个视野，计数发绿色荧光细胞数，取平均值表示凋亡细胞数。细胞凋亡指数以凋亡细胞数与视野下细胞总数的比值表示。实验重复3次取均值。

1.2.5 SOD活性与MDA、TBARS含量测定：37 ℃孵育48 h后，收集各组细胞培养上清液，按SOD、MDA和TBARS试剂盒说明书操作，分别于酶标仪532、550、535 nm处测定吸光度。

1.2.6 Western blot检测cTnT、CK-MB、Myo、HIF-1α、VEGF蛋白表达：37 ℃孵育48 h后，提取细胞总蛋白，并用二喹啉甲酸法进行定量。100 ℃加热5 min至蛋白变性后，每组取蛋白样品上样，进行SDS-PAGE，常规湿法转膜。封闭PVDF膜后，用1∶500倍稀释的cTnT、CK-MB、Myo、β-actin、HIF-1α和VEGF抗体于4 ℃分别孵育膜24 h。洗涤后加入1∶5000倍稀释的二抗，37 ℃孵育1 h。加入ECL化学发光剂显影，凝胶成像系统扫描分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用SNK-q检验，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组细胞增殖和凋亡情况比较 与空白对照组比较，缺氧组的增殖活力降低、凋亡指数明显升高，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。与缺氧组比较，各剂量肉桂组的增殖活力以剂量依赖性的方式逐渐升高，而凋亡指数则逐渐下降，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖和凋亡情况比较

2.2 各组细胞氧化应激相关指标比较 与空白对照组比较，缺氧组细胞上清液SOD活性较低，MDA、TBARS含量较高，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。与缺氧组比较，各剂量肉桂组细胞上清液SOD活性以剂量依赖性逐级增加，而MDA和TBARS含量则逐渐降低，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞氧化应激相关指标比较

2.3 各组细胞心肌损伤标志蛋白比较 Western blot检测cTnT、CK-MB和Myo蛋白表达，缺氧组中各蛋白表达较空白对照组高，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。各剂量肉桂组与缺氧组比较，三种标志蛋白表达量均以剂量依赖性逐级降低，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。见表3(图1)。

表3 各组细胞心肌损伤标志蛋白表达比较

图1 各组细胞cTnT、CK-MB和Myo蛋白表达

2.4 各组细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达比较 Western blot检测各组HIF-1α和VEGF蛋白表达，缺氧组中这两种蛋白表达比空白对照组高(均P<0.05)；各剂量肉桂组与缺氧组比较，HIF-1α、VEGF蛋白表达以剂量依赖性逐级增高(均P<0.05)。见表4(图2)。

表4 各组细胞中HIF-1α、VEGF蛋白表达比较

图2 各组细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达

3 讨 论

肉桂是一种具有强抗氧化活性的植物，在中医学中常用于改善心脏功能。研究显示在局部心肌缺血大鼠模型中，肉桂皮提取物对缺血性心律不齐和心脏损伤具有保护作用[10-12]。SOD、MDA、TBARS等氧化指标常用来反映机体氧化应激水平[13-14]。SOD是一种生命体内源抗氧化酶，可清除自由基[15-16]。MDA是脂质过氧化的产物，可加剧细胞膜的损伤[17-19]。本研究发现肉桂处理后能明显提高心肌细胞SOD活性，降低MDA、TBARS含量。表明肉桂对缺氧诱导的氧化应激有较好的保护作用，其机制可能与清除自由基和减少脂质代谢产物密切相关。缺氧处理促使心肌损伤标志蛋白cTnT、CK-MB和Myo的表达量显著升高，而肉桂处理可以剂量依赖性的方式抑制这三种标志蛋白表达量的升高[20-21]。说明肉桂对缺氧诱导的心肌细胞损伤有保护作用。

HIF-1α在缺血性心肌病与心力衰竭中通过参与血管张力调节、血管生长因子、葡萄糖摄取以及糖酵解等途径调控氧的传递，增强缺氧组织的存活能力，发挥心肌保护作用[22-24]。本研究结果显示心肌缺氧细胞HIF-1α蛋白水平明显提高，分析为缺氧处理初期心肌细胞的适应性反应。研究发现，三七总皂苷通过自噬的HIF-1α/BNIP3途径减轻心肌缺血再灌注损伤[25-26]。七氟醚通过Akt /HIF-1α/VEGF信号通路减轻心脏的氧化应激，改善缺血再灌注引起的心肌损伤[27-29]。本研究发现，肉桂可上调缺氧心肌细胞中VEGF蛋白表达水平。据此推断肉桂可能通过促进HIF-1α及VEGF高表达来保护血管内皮细胞、促进血管新生，从而保护缺氧介导的心肌细胞损伤。

综上所述，肉桂对慢性缺氧心肌细胞具有保护作用，其机制可能与激活HIF-1介导的低氧反应通路有关，初步揭示了肉桂的心脏保护作用机制，为肉桂治疗缺血性心脏病提供实验依据。