白藜芦醇抑制肾移植大鼠肾损伤

王 凯，李 明，乔良伟，曲青山

(郑州人民医院 器官移植科, 河南 郑州 450003)

肾缺血再灌注损伤(renal ischemic reperfusion injury, RIRI)是指肾脏经历一定时间缺血再次恢复血流供应后，功能代谢障碍及结构功能破坏出现加重的现象，是影响肾移植术后移植物功能恢复和长期存活的重要因素[1-2]。白藜芦醇(resveratrol)是一种天然多酚类化合物，具有抗癌、抗感染、抗氧化、保护心血管和神经系统、免疫调节等生物学活性[3]。研究表明，白藜芦醇可治疗肾缺血再灌注损伤，对抗氧化应激和炎性级联反应，但其作用机制尚不清晰[4-5]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路是经典促炎信号传导途径，可激活并扩大机体炎性反应，加重缺血再灌注损伤[6-7]。本研究以NF-κB信号通路为切入点，观察白藜芦醇对肾移植大鼠肾损伤的改善作用，并探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级SD大鼠70只，6周龄，体质量180～220 g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司。研究方案获郑州人民医院伦理委员会批准(20210003)。

1.1.2 试剂：白藜芦醇(纯度>98%，上海一基实业有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；Revert AidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientificals公司)；引物(TaKaRa公司)；IKK-α、IκB-α、p-IκB-α、NF-κB p65、GAPDH兔源单克隆抗体，羊抗兔二抗(CST公司)；Marker(SMOBiO公司)；RIPA裂解液、蛋白定量试剂盒、HE染色试剂盒、脱脂奶粉、ECL发光液、PVDF转印膜(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠分为假手术组、模型组(从阴茎背静脉注射125 U/mL的肾素0.5 mL，造成大鼠肾素化，结扎左肾动静脉，取出左肾，灌注4 ℃乳酸林格氏液至肾脏呈黄白色，置于器官保存盒备用。受体大鼠取肾方法同上，将供体肾在显微镜下吻合肾动脉、静脉和神经，缝合腹部，消毒，给予适量庆大霉素抗感染)、白藜芦醇高和低剂量组[造模前7 d腹腔注射40和20 mg/(kg·d)白藜芦醇]，每组10只。术后24 h取标本。

1.2.2 血清Cr、BUN、MDA含量和SOD活性的检测：术后24 h分离血清，分装在EP管中，置于-80 ℃超低温冰箱中冻存。通过Au2700型全自动生化分析仪检测各组大鼠血清中Cr、BUN的含量。MDA含量检测：取各组待测血清100 μL，按照说明书依次加入反应试剂，置于100 ℃水浴中孵育60 min，冰浴冷却，10 000×g常温离心10 min，吸取200 μL上清液加入玻璃比色皿中，测定各样品在450、532和600 nm处的吸光度A值，计算ΔA450=A450测定-A450空白，ΔA532=A532测定-A532空白，ΔA600=A600测定-A600空白，MDA含量(μmol/L)=5×[12.9×(ΔA532-ΔA600)-2.58×ΔA450]。SOD活性检测：取各组待测血清20 μL，按照说明书依次加入反应试剂，37 ℃孵育30 min，450 nm波长测定吸光度(A)值，计算抑制百分率，按照标准曲线计算待测样品的SOD酶活力(U/mL)。

1.2.3 RT-qPCR法检测肾组织Bax和Bcl-2 mRNA表达水平：术后24 h分离肾组织，每组称取0.1 g，冰上研磨，加1 mL Trizol裂解液提取组织总RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成cDNA，作为荧光定量模版，所有样品均以GAPDH为内参。反应体系：dNTPs 0.5 μL+5×缓冲液2.5 μL+Taq 酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA 模板2 μL +上下游引物分别1 μL，加去离子水至总体积25 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，重复40个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 5 min终止反应，实验重复3次。采用2-△△Ct的方法计算目的基因mRNA相对表达水平的变化。引物序列见表1。

表1 基因的引物序列Table 1 Gene primer sequence

1.2.4 Western blot检测肾组织IKKα、p-IκBα和NF-κB p65蛋白表达:称取各组大鼠肾组织0.1 g，剪碎后置于研磨器中冰上研磨，离心后取沉淀，沉淀中加入RIPA裂解液处理组织匀浆，提取组织蛋白，BCA法蛋白定量，确定蛋白浓度，随后配置15%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，上样后80 V电泳2 h，60 V转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，将条带放入10 mL的IKK-α(1∶2 000)、NF-κB p65(1∶2 000)兔源一抗稀释液中，条带在一抗稀释液中4 ℃过夜，第2天用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，TBST缓冲液清洗3次后滴加ECL发光液，反应1 min后置于凝胶成像系统显影。免疫印迹实验的内参蛋白为GAPDH，用Image J软件分析各个蛋白对应的吸光度值，计算蛋白的相对表达量，蛋白相对表达量=目的蛋白吸光度值/内参蛋白吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 白藜芦醇对各组大鼠血清Cr、BUN、SOD和MDA的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清Cr、BUN和MDA含量均增高，而SOD活性降低；与模型组比较，白藜芦醇高和低剂量组大鼠血清Cr、BUN和MDA含量均降低，SOD活性增加(P<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠血清Cr、BUN、MDA含量和SOD活性比较Table 2 Comparison of serum Cr, BUN, MDA content and SOD activity of rats in each n=10)

2.2 白藜芦醇对各组大鼠肾组织Bax和Bcl-2 mRNA表达水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中Bax mRNA表达水平显著增加，而Bcl-2 mRNA表达水平显著降低；与模型组比较，白藜芦醇高剂量组和低剂量组大鼠肾组织中Bax mRNA表达水平显著降低，Bcl-2 mRNA表达水平显著增加(P<0.05)(表3)。

表3 各组大鼠肾组织Bax和Bcl-2 mRNA表达水平比较

2.3 白藜芦醇对各组大鼠肾组织IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表达均增加；与模型组比较，白藜芦醇高剂量组和低剂量组大鼠肾组织中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65表达水平显著降低(P<0.05)(图1，表4)。

表4 各组大鼠肾组织IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白相对表达水平比较

3 讨论

目前，RIRI是除免疫排斥反应之外肾移植手术的另一主要难题，是导致肾移植手术失败和移植肾脏功能丧失的重要原因[8]。造成RIRI的主要因素是活性氧的氧化损伤和其激活的炎性级联反应，目前尚无有效治疗方法[9]。白藜芦醇是一种天然多酚类化合物，研究表明，白藜芦醇可改善疾病、药物、缺血再灌注等导致的肾脏损伤，是预防肾损伤的补充疗法，但其作用机制尚不清晰[10]。本研究建立了大鼠肾移植模型，观察白藜芦醇对大鼠肾移植后肾损伤的改善作用并探究其作用机制。

A.sham group; B.model group; C.resveratrol high-dose group; D.resveratrol low-dose group图1 白藜芦醇对各组大鼠肾组织IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表达的影响Fig 1 Effect of resveratrol on the expression of IKKα, p-IκBα, and NF-κB p65 protein in renal tissues of rats in each group n=10)

本研究结果显示，模型组大鼠血清中Cr、BUN和MDA的含量增高，SOD活性降低，而使用白藜芦醇进行预处理后，白藜芦醇高和低剂量组大鼠血清中Cr、BUN和MDA的含量均降低，SOD活性增加，表明白藜芦醇能够抑制肾缺血再灌注损伤产生的氧化应激反应，提高机体抗氧化能力。Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡的关键基因，Bax过表达可促进细胞凋亡，而Bcl-2可与Bax形成二聚体，抑制Bax基因的表达，从而抑制细胞凋亡[11]。与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中Bax mRNA表达显著增加，Bcl-2 mRNA表达显著降低，而采用白藜芦醇对大鼠进行预处理后，白藜芦醇高和低剂量组大鼠肾组织Bax mRNA表达显著降低，Bcl-2 mRNA表达显著增加，表明白藜芦醇可减轻肾缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡。NF-κB信号通路是经典炎性信号通路，NF-κB在静息状态下与IκB结合，在IKK的诱导下发生磷酸化，使NF-κB活化并向细胞核转移，调节炎性因子释放，从而促进缺血再灌注损伤[12-13]。与假手术组比较，模型组大鼠肾组织中IKKα、p-IκBα、NF-κB p65蛋白表达均增加，白藜芦醇预处理可显著降低大鼠肾组织IKKα、p-IκBα、NF-κB p65的表达水平，表明白藜芦醇可抑制肾移植大鼠NF-κB信号通路的活化。

综上所述，白藜芦醇对肾移植大鼠肾损伤具有保护作用，可改善移植肾功能，提高机体抗氧化能力，抑制细胞凋亡，其作用机制与抑制NF-κB信号通路的活化有关。