白花蛇舌草上调miR-485-5p抑制人膀胱癌细胞系KU-19-19增殖、迁移和侵袭

徐林飞，张海涛，刘 晟，蔡海荣，胡恩平

(台州市立医院 泌尿外科，浙江 台州 318000)

膀胱癌(bladder cancer)是世界范围常见的泌尿系统恶性肿瘤，具有发病率高、细胞分化差、侵袭能力强等特点。化疗药的应用尽管降低了膀胱癌复发转移率，但其在杀死癌细胞的同时往往引起机体严重的不良反应。白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)为茜草科耳草属植物白花蛇舌草的全草，除具有清热解毒、利尿消肿功效外，其通过调控细胞周期、抑制增殖和诱导凋亡对肺癌、卵巢癌等恶性肿瘤表现出显著的抗肿瘤作用[1-2]。此外，白花蛇舌草对膀胱癌细胞亦具有显著的增殖抑制和凋亡诱导作用[3-4]。然而，其抗肿瘤作用的潜在机制并不明确。miR-485-5p是近年来发现的抑癌基因，多种癌中miR-485-5p表达下调并促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[5]。黄岑苷通过上调miR-485-5p表达可抑制前列腺细胞增殖[6]。然而miR-485-5p在膀胱癌是否具有抑癌作用尚未可知。本研究通过观察白花蛇舌草对膀胱癌细胞系KU-19-19增殖、迁移、侵袭以及miR-485-5p表达的影响，探讨白花蛇舌草抗肿瘤作用的潜在分子机制，以期为膀胱癌治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱癌细胞系KU-19-19(南京科佰生物)；白花蛇舌草(Hedyotis diffusa，安徽中药材批发市场)；细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit，CCK-8)(日本同仁化学研究所)；miR-485-5p模拟物(miR-485-5p mimics)、抑制物(anti-miR-485-5p)及其相应对照(miR-NC、anti-miR-NC)(广州锐博生物科技有限公司)；兔抗基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)抗体、兔抗MMP9抗体、兔抗磷酸化的磷脂酰肌醇-3-羟激酶(phosphorylated phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，p-PI3K)抗体、兔抗磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-AKT)抗体、兔抗β-actin抗体、山羊抗兔二抗(上海艾博抗贸易公司)；LY294002(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养和分组处理：用含10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃含5% CO2的细胞培养箱中培养KU-19-19细胞。当细胞汇合度达到80%时，按照1∶3比例稀释进行传代，取对数增殖期细胞用于后续实验。取干燥白花蛇舌草干燥全草，浸泡煮沸一段时间后，过滤，将浓缩液过滤后加入乙酸乙酯和乙醇抽提，获得纯度较高的提取物，过滤除菌后4 ℃冰箱保存备用[3]。将KU-19-19细胞分别用白花蛇舌草浓度为25、50和100 μmol/L的培养液处理48 h，CCK-8法检测细胞增殖率，确定最适白花蛇舌草浓度。

将KU-19-19细胞分为对照组；白花蛇舌草组(100 μmol/L的培养液处理48 h)；miR-NC组(转染miR-NC)；miR-485-5p组(转染miR-485-5p mimics)；anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)；anti-miR-485-5p组(转染anti-miR-485-5p)；白花蛇舌草+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)；白花蛇舌草+anti-miR-485-5p组(转染anti-miR-485-5p)；白花蛇舌草+anti-miR-485-5p+LY294002组(转染anti-miR-485-5p后，用白花蛇舌草浓度为100 μmol/L的培养液处理48 h，再用10 μmol/L的LY294002处理30 min)。细胞转染参照LipofectamineTM2000说明书进行。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力：按照5×103个/孔接种96孔板，培养24 h后加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，使用酶标仪检测各孔450 nm处吸光度值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=[(A实验孔-A空白孔)/(A对照孔-A空白孔)]×100%

1.2.3 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭：无血清培养基重悬各组细胞制备单细胞悬液，取5×103个细胞接种Transwell上腔室，下层24孔板中加入含10%血清培养基。37 ℃孵育24 h后，擦去上腔室未转移细胞。多聚甲醛固定下腔室膜10 min，结晶紫染液染色30 min，在倒置显微镜下观察细胞迁移情况，拍照，记录迁移细胞数量。侵袭实验时用100 μL无血清培养基稀释的终浓度为1 g/L的基质胶包被上腔室膜，37 ℃培养箱凝固后备用，后续操作同迁移实验。

1.2.4 RT-qPCR检测miR-485-5p表达：Trizol法提取细胞内总RNA，反转录为cDNA后，RT-qPCR法检测miR-485-5p表达水平。miR-485-5p的上游引物序列为5′-AGAGGCTGGCCGTGATG-3′，下游引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；内参U6的上游引物序列为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA AT-3′，下游引物序列为5′-CGCTTCACGAATTTGC GTGTCAT-3′。2-ΔΔCt法分析miR-485-5p相对表达量。

1.2.5 蛋白质印记(Western blot)检测MMP2、MMP9、p-PI3K和p-AKT蛋白表达：RIPA裂解法获得细胞蛋白。取等量的蛋白样品上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿法转移至硝酸纤维素膜，用5%牛血清白蛋白37 ℃封闭1 h，37 ℃孵育一抗(MMP2为1∶500，MMP9、p-PI3K和p-AKT为1∶1 000)2 h，37 ℃孵育二抗(1∶2 000)1 h。用化学发光显色试剂盒显影，以β-actin为内参，扫描吸光度值分析目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度白花蛇舌草对KU-19-19细胞增殖的影响

与NC组比较，白花蛇舌草(25、50和100 μmol/L)干预组细胞增殖率显著降低(P<0.05)。选取100 μmol/L白花蛇舌草进行后续实验(表1)。

表1 不同浓度白花蛇舌草对KU-19-19细胞增殖的影响

2.2 白花蛇舌草对KU-19-19细胞迁移和侵袭的影响

与NC组比较，白花蛇舌草(100 μmol/L)组KU-19-19细胞迁移、侵袭细胞数、MMP2和MMP9蛋白表达显著降低(P<0.05)(表2，图1)。

图1 Western blot检测MMP2、MMP9蛋白的表达Fig 1 Western blot detected the expression of MMP2 and MMP9 protein

表2 白花蛇舌草对KU-19-19细胞迁移和侵袭的影响Table 2 Effect of Hedyotis diffusa on the migration and invasion of KU-19-19 cells n=9)

2.3 白花蛇舌草对miR-485-5p表达的影响

白花蛇舌草组KU-19-19细胞miR-485-5p表达量为3.57±0.31，显著高于NC组的1.00±0.11(P<0.05)。

2.4 miR-485-5p对KU-19-19细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与miR-NC组比较，miR-485-5p组KU-19-19细胞增殖率、迁移侵袭细胞数、MMP2和MMP9蛋白表达显著降低；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-485-5p组KU-19-19细胞增殖率、迁移侵袭细胞数、MMP2和MMP9蛋白表达显著升高(P<0.05)(表3，图2)。

表3 miR-485-5p对KU-19-19细胞增殖、迁移和侵袭的影响Table 3 Effects of miR-485-5p on the proliferation, migration and invasion of KU-19-19 cells n=9)

图2 Western blot检测MMP2、MMP9蛋白的表达Fig 2 Western blot detected the expression of MMP2 and MMP9 protein

2.5 抑制miR-485-5p可以逆转白花蛇舌草对KU-19-19细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与白花蛇舌草+anti-miR-NC组比较，白花蛇舌草+anti-miR-485-5p组KU-19-19细胞miR-485-5p的表达水平显著降低，细胞增殖率、迁移侵袭细胞数、MMP2和MMP9蛋白表达显著升高(P<0.05)(表4，图3)。

表4 Anti-miR-485-5p可以逆转白花蛇舌草对KU-19-19细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图3 Western blot检测MMP2、MMP9蛋白的表达Fig 3 Western blot detected the expression of MMP2 and MMP9 protein

2.6 LY294002可以减弱anti-miR-485-5p逆转白花蛇舌草对KU-19-19细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与白花蛇舌草+anti-miR-485-5p组比较，白花蛇舌草+anti-miR-485-5p+LY294002组KU-19-19细胞增殖率、迁移侵袭细胞数、MMP2和MMP9蛋白表达显著降低，p-PI3K、p-AKT表达显著降低(P<0.05)(表5，图4)。

表5 LY294002可以减弱anti-miR-485-5p逆转白花蛇舌草对KU-19-19细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图4 Western blot检测MMP2、MMP9、p-PI3K、p-AKT蛋白的表达Fig 4 Western blot detected the expression of MMP2, MMP9, p-PI3K, and p-AKT protein

3 讨论

本研究发现白花蛇舌草可抑制KU-19-19细胞增殖、迁移和侵袭，降低MMP2和MMP9蛋白表达水平，并提高miR-485-5p的表达水平。提示，白花蛇舌草对KU-19-19细胞的抗肿瘤作用与上调miR-485-5p表达有关。

miR-485-5p已被证实与多种恶性肿瘤的发生和转移有关。黑色素瘤细胞中miR-485-5p表达降低，过表达miR-485-5p可降低肿瘤细胞的增殖和转移能力，是肿瘤治疗的潜在靶点[7]。过表达miR-485-5p还可抑制乳腺癌进展并提高其化疗敏感性[8]。本研究通过转染miR-485-5p mimics、anti-miR-485-5p分别上调或下调miR-485-5p表达发现，过表达miR-485-5p可抑制KU-19-19细胞的增殖、迁移和侵袭能力，与白花蛇舌草对KU-19-19细胞的抗肿瘤作用一致，而抑制miR-485-5p表达则具有相反的作用。进一步研究显示，抑制miR-485-5p表达还可逆转白花蛇舌草对KU-19-19细胞增殖、迁移和侵袭的影响。以上结果表明，白花蛇舌草可能通过上调miR-485-5p表达在膀胱癌中发挥抗肿瘤作用。

PI3K/AKT通过调控下游信号分子活化状态具有促进细胞增殖和转移、拮抗细胞凋亡的重要作用，与多种恶性肿瘤进展有关。膀胱癌中PI3K/AKT信号通路异常激活，miRNA、中药提取物等通过抑制PI3K/AKT信号通路活化可减弱膀胱癌细胞的增殖和迁移能力，抑制肿瘤进展[9-10]。白花蛇舌草通过抑制PI3K/AKT信号通路还可抑制肝癌细胞裸鼠移植瘤的形成[11]。最近研究显示，miR-485-5p对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用与阻断PI3K/AKT信号通路有关[12]。本研究发现，使用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002可逆转抑制miR-485-5p表达对白花蛇舌草干预的KU-19-19细胞增殖、迁移和侵袭的影响。提示，白花蛇舌草可能通过上调miR-485-5p抑制PI3K/AKT信号通路，进而在膀胱癌中具有增殖和迁移侵袭抑制作用。

综上所述，白花蛇舌草通过上调miR-485-5p能够抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关，这为临床上白花蛇舌草用于治疗膀胱癌奠定了理论基础。