YAP 干扰腺病毒载体对宫颈癌增殖、迁移及侵袭的影响

王红 ，王恳 ，焦庆昉 ，杨万全 ，张镇 ，李婕婷 ，吴扶生 ，王瑾

作者单位：1 四川省中西医结合医院肿瘤科，四川 成都 610041；2 中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院血液科，河南 洛阳 471003

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，全世界范围内宫颈癌的新确诊病例超过 52.98 万∕年，是妇女癌症死亡的主要原因之一，其中大部分病人集中在发展中国家。目前手术、化疗及放疗是治疗宫颈癌的主要手段，但大部分病人仍发生复发转移，导致大部分病人的生存率无明显提高。Yes-associated protein（YAP）是 Hippo 信号通路下游的转录激活因子，YAP 蛋白参与了肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭过程，在肿瘤发展过程中发挥重要作用。本团队于 2017年 7月至 2018年 10月利用腺病毒靶向 YAP 干扰载体（pAd-si-YAP），了解 YAP 蛋白对宫颈癌细胞的恶性增殖及侵袭性的作用，为全方面了解宫颈癌的分子生物学机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

pAd-si-YAP、重组空载体腺病毒（pAdmock）均由中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院构建。人宫颈癌 CaSki 细胞株由中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院保存。DMEM 培养基及胎牛血清购自美国 HyClone 公司；Transwell 培养板购自美国 Gibco 公司；鼠抗人 β 肌动蛋白（β-actin）及 YAP 抗体购自美国 Santa Cruz 公司；RNase、碘化丙啶购自上海碧云天生物技术有限公司。荧光定量聚合酶链反应（qPCR）引物由TaKaRa 公司合成，测序也由该公司完成。

1.2 细胞培养及细胞感染

配置好含 10% 胎牛血清、100 U∕mL 青霉素及 100 U∕mL 链霉素细胞培养液，将 CaSki 细胞置于 37 ℃、5% 二氧化碳细胞孵箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。将 CaSki 细胞接种于 6 孔板中，待密度约为 80% 时，取二孔细胞计数后 ，加入200感染复数（MOI）的重组腺病毒pAd-si-YAP 及无血清的 DMEM，感染 2 h 后，1 000 r∕min×5 min 离心后弃上清，加入含有血清的 DMEM完全培养液；取二孔细胞计数后，加入 200 MOI 的pAd-mock 及无血 清 的 DMEM，感染 2 h 后，1 000 r∕min×5 min 离心后弃上清，加入含有血清的 DMEM完全培养液。另取二孔细胞计数后，加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）作为空白对照。由于腺病毒载体中含有编码的绿色荧光蛋白（GFP）基因，因此可在荧光显微镜下观察感染效率情况。待 CaSki 细胞感染 48 h 后，随机选择 6 个视野计数，在荧光显微镜下观察病毒感染情况，计算绿色荧光细胞 占全部细胞的比例。

1.3 qPCR 检测 YAP mRNA 的表达

收集培养48 h的感染细胞及正常CaSki细胞，利用 Trizol 法提取CaSki 细胞的总 RNA，进行 qPCR 并进行定量。根据GeneBank 中YAP及 β-actin 设计引物并由 TaKaRa公司合成。YAP 正向引物 5’-CCG CAA CTG CAG ATG GAG AC-3’，反向引物 5’-CCA TCC CGG GAG AAG ACA CA-3’，β -actin 正向引物 5’-CCT CGT CCC CTA CAT CGT-3’，反向引物 5’-GAC GGT GTA GCC CCA CGA AA-3’。qPCR 反应条件：95 ℃变性1 min，60 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 50 s，33 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。

1.4 蛋白质印迹法（Western blotting）检测 YAP 蛋白表达

CaSki 细胞感染重组腺病毒 Ad-si-YAP 及pAd-mock 48 h 后，收集细胞，提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，蛋白样品加样 60 微克∕孔，电泳、转膜、封闭，然后加入一抗 4 ℃过夜，后 TBST 缓冲液洗膜3 次，每次洗膜 10 min 后，再与 HRP 标记的二抗（1∶3 000 稀释，即 3 mL 牛奶中加 1 μL 二抗），室温下孵育 1 h。后再予 TBST 缓冲液洗涤 3 次后，应用 ECL化学发光剂检测目的蛋白表达并进行半定量分析。

1.5 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT 法）检测细胞增殖活力

根据“1.2”方法制备 Ad-si-YAP及 pAd-mock 感染细胞，计数约 10 000 个细胞∕孔接种于 96 孔板，后放回细胞孵箱中继续培养，分别于接种后 24、36、48、60 h 取出一块 96 孔板，加入 20 μL 6 g∕L 的 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT），后继续孵育 4 h 后，弃上液，加入 150 μL 的二甲基亚砜（DMSO），震荡约 15 min 后于酶标仪 560 nm 处测吸光度。

1.6 流式细胞仪测检测细胞周期及凋亡

分别用Ad-si-YAP 及 pAd-mock 感染细胞 48 h 后，收集细胞，加入 70% 乙醇固定，后放入 4 ℃冰箱过夜，后用 PBS清洗，后加入核糖核酸酶 A（RNase A），在 37 ℃水浴30 min，后碘化丙啶（PI）避光染色 30 min，后应用流式细胞仪分析细胞周期及凋亡。

1.7 划痕试验检测细胞迁移能力

CaSki 细胞以 3×10密度接种于 6 孔板，当细胞生长密度达到 80%，用 10 μL 小枪头行“一”字划痕，后丢弃培养基，PBS轻轻清洗 3 次，后加入 5% 胎牛血清的 DMEM 培养基，显微镜下观察并拍照，于此时记为 0 h，后继续培养 24 h，后在同一观察点观察划痕愈合情况，通过计算观察点划痕宽度平均值，计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）=（0 h 划痕宽度―24 h 划痕宽度）∕0 h 划痕宽度×100%。

1.8 细胞侵袭试验

取 24 孔板并加入 600 μL 不含血清的 DMEM 培养基，将 Transwell 小室及侵袭小室放入 24 孔板中，放入 37 ℃细胞孵箱中平衡备用。接种 CaSki 细胞于 6 孔板中，经过 12 h 培养后，分别予 Ad-si-YAP 及 pAd-mock 感染细胞 12 h，对照组予PBS 处理，后用胰酶消化细胞呈悬液后，以每孔 5×10∕200 μL 接种予经过平衡的处理的 Transwell 小室及侵袭小室，于 37 ℃细胞孵箱中继续培养。24 h 后去除 Transwell 小室及侵袭小室中残液，于冰甲醛中固定 15 min，后予 0.1% 的结晶紫染色液中染色 20 min，PBS 清洗后晾干，每孔随机取 5 视野于 100 倍镜下计数。

2 结果

2.1 pAd-si-YAP 及 pAd-mock 感染 CaSki 细胞

pAd-si-YAP 感染效率为（93.1±2.4）% ，pAd-mock 感染效率为（92.8±3.1）%，见图1。

图1 荧光显微镜下观察宫颈癌CaSki细胞感染48 h后病毒感染情况（×10）：A为腺病毒靶向YAP干扰载体（pAd-si-YAP）感染CaSki细胞；B为重组空载体腺病毒（pAd-mock）感染CaSki细胞

2.2 qPCR 检测YAP mRNA 的表达

Ad-si-YAP感染 CaSki 细胞的 YAP mRNA 表达明显低于 pAdmock 感染的 CaSki 细胞及 PBS 处理的CaSki 细胞［（22.01±0.24）比（80.12±0.31）、（84.18±0.22），

P

＜0.05］，表明 Ad-si-YAP 可以抑制 YAP 基因转录。本实验重复 3 次。

2.3 蛋白质印迹法检测 YAP 蛋白表达

Ad-si-YAP感染 CaSki 细胞的 YAP 蛋白表达低于 pAd-mock 感染 的 CaSki 细胞及PBS处理的 CaSki 细胞［（0.6±0.018）比（1.5±0.031）、（1.8±0.27），

P

＜0.05］，表明 Adsi-YAP 可以干扰 YAP 基因表达。见图2。

图2 蛋白质印迹法检测宫颈癌 CaSki 细胞 YAP 蛋白表达

2.4 MTT 法检测细胞增殖活力

24 h 后 pAd-mock感染的 CaSki 细胞及 PBS 处理的 CaSki 细胞增殖明显快于 Ad-si-YAP 感染 CaSki 细胞（

P

＜0.05），而 pAdmock 感染的 CaSki 细胞相比 PBS 处理的 CaSki 细胞增殖趋势大致相同（

P

＞0.05），说明沉默 YAP 基因可以抑制 CaSki 细胞增殖。见表1。

2.5 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡分析

本研究发现通过沉默 YAP 后，CaSki 细胞周期停滞于 G0∕G1 期明显增加（

P

＜0.05），同时 CaSki 细胞增多（

P

＜0.01），而 pAd-mock 感染的 CaSki 细胞相比 PBS 处理的 CaSki 细胞周期分布及凋亡差异无统计学意义（

P

＞0.05），见表2。

表1 MTT 法检测宫颈癌 CaSki 细胞增殖活力（吸光度）结果∕

表2 流式细胞仪测检测 CaSki 细胞周期分布及凋亡结果∕（%，）

2.6 划痕试验检测细胞迁移能力

沉 默 YAP 后CaSki 细胞的划痕愈合占比下降［（40.01±0.16）%比（81.02±0.22）%、（86.04±0.31）%，

P

＜0.05］，从而说明YAP 可以促进CaSki 细胞迁移。

2.7 细胞侵袭试验

沉默 YAP 后 CaSki 细胞的侵袭细胞数下降［（120±4）个 比（640±3）个 、（680±4）个，

P

＜0.05］，而 pAd-mock 感染的 CaSki 细胞及 PBS处理的 CaSki 细胞 ，其侵袭力差异无统计学意义［（640±3）个比（680±4）个，

P

＞0.05］，说明 YAP 可以提高 CaSki 细胞侵袭能力。

3 讨论

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，仅次于乳腺癌，占女性肿瘤第二位，严重威胁女性病人的生命，对社会及病人造成严重的负担。大部分病人确诊宫颈癌时，已经发生淋巴结及远处转移，而发生转移的病人预后很差。深入研究宫颈癌分子生物学特性，寻找更多潜在治疗靶点，是摆在肿瘤科研人员面前的重要课题。YAP 基因位于染色体 11q22 区，被认为是一种原癌基因，其编码产生YAP 蛋白，作为一种转录共激活因子，促进 Hippo 通路中的下游目的基因表达，从而促进细胞生长，抑制细胞凋亡，因此认为 YAP 基因为原癌基因。如果YAP 异常活化，则 YAP 蛋白与转录 因 子 TEAD 相 结合促进基因转录，诱导上皮间质细胞转化，并增强细胞增殖，可抑制细胞凋亡，增强肿瘤细胞转移和侵袭能力。宫颈癌的发病机制极其复杂，目前认为是多因素、多基因、多阶段共同参与导致的结果，其中细胞信号传导通路对宫颈癌的发生、发展起着至关重要的作用。现发现，Hippo-YAP 信号是众多信号通路中，调节宫颈癌形成的一条重要传导通路。YAP 是 Hippo 通路中的核心效应因子，在机体内发挥胞内信号传导和转录调节等作用，而 Hippo-YAP 信号通路可调控机体器官的大小，调节肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等恶性行为，因而成为肿瘤研究中的热点。Liu 等采用免疫组织化学方法分析检测 120例宫颈鳞状细胞癌、42例宫颈腺癌、22例正常宫颈组织的 YAP 表达水平，同时对细胞质与细胞核中的 YAP 表达进行单独分析，发现YAP 蛋白在肿瘤中表达水平明显高于正常组织，而李娜等则证明 YAP 蛋白表达越高，宫颈癌的恶性侵袭性越强，同时病情进展越快。

本团队在之前工作基础上将 pAd-si-YAP 转染CaSki 细 胞，发现 Ad-si-YAP 可以抑制 CaSki 细胞的YAP 蛋白表达，同时发现沉默 YAP 基因后 CaSki 细胞的细胞周期发生改变，S 期细胞比例减少，凋亡细胞增加，本团队拟下一步深入研究 YAP 蛋白与细胞周期蛋白之间的关系。肿瘤细胞的侵袭及转移机制，涉及多种信号转导通路以及肿瘤微环境的相互作用，本研究发现沉默 YAP 基因后 CaSki 细胞的迁移能力及侵袭能力相对于对照组均有不同程度下降，本团队下一步将进一步研究 Hippo-YAP 通路的具体作用机制及其如何与其他信号通路相互作用，为全方面了解宫颈癌的分子生物学机制提供依据，以期为宫颈癌综合治疗及 Hippo 信号传导通路的调节提供一个潜在靶点。