PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体优化及蛋白表达

程艳，万婷婷，薛荣亮

·论著·

PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体优化及蛋白表达

程艳，万婷婷，薛荣亮

710068 西安，陕西省人民医院麻醉科（程艳）；710100 西安，西安国际医学中心医院麻醉与舒适化医疗中心（薛荣亮）；100191 北京，北京大学第三医院麻醉科（万婷婷）

优化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重组表达载体以增加 SOD 融合蛋白表达。通过基因工程设计引物并优化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重组表达载体，扩增并鉴定目的基因，将优化后的原核重组表达载体以热激法转化至BL21(DE3) 中，通过 IPTG 诱导重组载体进行蛋白表达，通过溶菌酶 + 超声裂解菌体，离心后收集上清，利用 Ni-NTA 树脂纯化，10 kD，20 kD 透析袋浓缩，以获得 SOD 融合蛋白。利用 SDS-PAGE 凝胶电泳及 Western blot 鉴定 SOD 融合蛋白。采用 BCA 与黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 融合蛋白浓度及活力。优化后的重组表达载体优化了稀有碱基，增加了 His·Tag 标签，His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD 序列作为一个整体，在I 与H I 限制性内切酶作用下定向插入，构建了长度为 6213 bp 的优化质粒，基因测序结果与预先设计的序列对比显示碱基序列正确。优化后的 SOD 融合蛋白表达量约占菌体的 32%，较前（20%）提高，纯化浓缩后纯度为 94%，较前（90%）增加。测定浓度为 1.8 mg/ml，37 ℃时 SOD 总活力为（3065.137 ± 19.75）U/mg prot。通过重组表达载体密码子优化，可以获得高产量、高活性的 SOD 融合蛋白。

蛋白质结构域； 超氧化物歧化酶； 质粒

过氧化反应与多种神经退行性疾病关系密切，其产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是造成神经元死亡的主要原因。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是针对 ROS 的主要抗氧化剂防御系统，但其分子量大且无特异性受体，难以穿过血脑屏障及细胞膜进入脑内发挥作用。蛋白质转导结构域（protein transduction domain，PTD）是一个以肽为载体的能够有效运输各种物质进入细胞和细胞核的系统，能够把生理状态下不能进入细胞发挥生物效应的物质带入细胞的载体工具[1]。PTD-4 结构域的二级结构具有双亲性，因而具有高效且快速的细胞转导能力[2]。

大肠杆菌原核表达体系是基因表达技术中发展最早，应用最广泛的经典表达系统，近几十年，大肠杆菌表达系统也得到不断发展和完善，被科研及工业用户大量用于各种重组蛋白表达。与其他表达系统相比，具有目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强、成本相对低等特点[3]。本课题组前期已成功构建 PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重组表达载体[4]，并成功制备 PTD4-Cu,Zn-SOD 融合蛋白（简称 SOD 融合蛋白）[5]。本实验在前期实验的基础上，在充分考虑大肠杆菌（BL21(DE3)）的密码子偏好的基础上，根据密码子的简并性，在不改变氨基酸的前提下，替换了原序列中的稀有密码子（AGG，AGA）以及低利用率密码子，选择大肠杆菌高偏好性的密码子，对 pET16b-PTD4-Cu, Zn-SOD 基因序列进行了优化，以期更加稳定地增加 SOD 融合蛋白的表达。

1 材料与方法

1.1 主要材料

BL21(DE3) 购自北京擎科新业生物技术有限公司；PTD4-Cu,Zn-SOD 基因序列由薛荣亮课题组提供；pET16b 质粒、pBluescript II SK-Cu, Zn-SOD 购自北京天恩泽基因科技有限公司；KOD plus DNA polymerase 购自日本 Toyobo 公司；DNA 连接试剂盒、限制性内切酶H I、I、T4DNA 连接酶购自日本 Takara 公司；质粒小量提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；西班牙琼脂糖、考马斯亮蓝染液、LB 固培养基、BCA 试剂盒购自西安赫特生物科技有限公司；His Tag 单克隆抗体、山羊抗小鼠 IgG 二抗-HRP 辣根过氧化物酶标记购自美国 Earthox 公司；IPTG购自美国 Sigma 公司；Bio-Rad 蛋白预染 marker 购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；HisPurTMNi-NTA Spin Columns 购自美国 Thermo Scientific；SDS-PAGE 试剂盒购自杭州弗德生物科技有限公司；SOD 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及优化 上游引物：5' ACCATGG GTCACCACCACCATCATCACCATCATCACCACTCTTCTGGTCACATCGAAGGTCGTCACATGCTGGAAATGTACGCTCGTGCTGCTGCTCGTCAGGCTCGTGCTATGGCTACCAAAGCTGTTTGCGTTCTGAAAGGTGAtGGcCCaGTTCAGGGTATCATCAACTTCGAACAGAAAGAATCTAACGGTCCGGTTAAAGTTTGGGGTTCTATCAAAGGTCTGACCGAAGGTCTGCACGGTTTCCACGTTCACGAATTCGGTGACAACACCGCTGGTTGCACCTCTGCTGGTCCGCACTTCAACCCGCTGTCTCGTAAACACGGTGGTCCGAAAGACGAAGAACGTCACGTTGGTGACCTGGGcAACGTTACCGCTGACAAAGACGGTGTTGCTGACGTTTCTATCGAAGACTCTGTTATCTCTCTGTCTGGTGACCACTGCATCATCGGTCGTACCCTGGTTGTTCACGAAAAAGCTGACGACCTGGGTAAAGGTGGTAACGAAGAATCTACCAAAACCGGTAACGCTGGTTCTCGTCTGGCTTGCGGTGTTATCGGTATCGCTCAGtaa 3'；下游引物：5' GCCGGATCCTTACTGAGCGATACCGATAACACCGCAAGCCAGACGAGAACCAGCGTTACCGGTTTTGGTAGATTCTTCGTTACCACCTTTACCCAGGTCGTCAGCTTTTTCGTGAACAACCAGGGTACGACCGATGATGCAGTGGTCACCAGACAGAGAGATAACAGAGTCTTCGATAGAAACGTCAGCAACACCGTCTTTGTCAGCGGTAACGTTGCCCAGGTCACCAACGTGACGTTCTTCGTCTTTCGGACCACCGTGTTTACGAGACAGCGGGTTGAAGTGCGGACCAGCAGAGGTGCAACCAGCGGTGTTGTCACCGAATTCGTGAACGTGGAAACCGTGCAGACCTTCGGTCAGACCTTTGATAGAACCCCAAACTTTAACCGGACCGTTAGATTCTTTCTGTTCGAAGTTGATGATACCCTGAACTGGGCCATCACCTTTCAGAACGCAAACAGCTTTGGTAGCCATAGCACGAGCCTGACGAGCAGCAGCACGAGCGTACATTTCCAGCATGTGACGACCTTCGATGTGACCAGAAGAGTGGTGATGATGGTGATGATGGTGGTGGTG 3'。整个引物序列的主体部分由 His·tag + PTD4 + Cu,Zn-SOD 序列构成，小写部分为未优化序列。在上游引物的 5'端加有限制性内切酶I 位点，即 CCATGG，下游引物的 5'端加有限制性内切酶H I 位点，即 GGATCC。ATG 为起始密码子，隐藏在限制性内切酶I 序列中，taa 为终止密码子。本研究只针对碱基序列进行了优化，氨基酸的表达并未改变，理论上与原碱基序列表达的蛋白无差异。上述引物由西安医智信生物科技有限公司合成。

1.2.2 目的基因扩增及鉴定 PCR 反应体系共 20 μl：目的基因上游引物（10 μmol/L）1 μl，目的基因下游引物（10 μmol/L）1 μl，KOD DNA polymerase 0.5 μl，10 × PCR buffer 2 μl，dNTP 2 μl，pBluescript II SK-Cu,Zn-SOD 模板 1 μl，MgSO42 μl，ddH2O 11.5 μl。目的基因扩增条件为：94 ℃预变性 1 个循环（3 min），94 ℃变性（30 s）、58 ℃退火（30 s）、68 ℃延伸（30 s）30 个循环，68 ℃延伸 1 个循环（5 min），完成目的基因扩增。双酶切反应，目的基因酶切体系共 30 μl：目的基因20 μl，H I 1 μl，I 1 μl，10 × K buffer 3 μl，ddH2O 5 μl，37 ℃水浴 4 h。pET16b 酶切体系共 30 μl：pET16b 2 μl，H I 1 μl，I 1 μl，10 × K buffer 3 μl，ddH2O 23 μl，37 ℃水浴 4 h。使用 T4 DNA 连接酶合成重组质粒，反应体系共 10 μl：目的基因（I/H I）5 μl，pET16b（I/H I）3 μl，10 × T4 DNA ligase buffer 1 μl，T4 DNA ligase 1 μl，PCR 仪中室温反应 2 h，4 ℃冰箱过夜。对重组质粒进行基因测序。

1.2.3 SOD 融合蛋白重组载体表达 将 1 μl 重组载体加入 100 μl 感受态细胞中，冰浴 30 min，42 ℃水浴热激 60 s，冰浴 2 min 后，向离心管中加入 500 μl 的 LB 液体培养基（不含 Amp），放置 37 ℃摇床 200 r/min 振荡 60 min，表达质粒中携带的抗生素抗性基因（Ampr）。将复苏好的菌液于 4000 r/min 离心振荡 5 min，弃掉上清 500 μl，保留底部的悬浮细胞 100 μl。吸取合适体积的菌液，均匀涂布于含有 Amp 的 LB 固体培养基上，随后将其置于 37 ℃恒温培养箱中，正面朝上放置 2 h 使菌液完全吸干，随后倒置培养皿，再置于 37 ℃恒温培养箱中过夜培养，直至生长出明显菌落（约 16 h）。最后将培养皿放置于 4 ℃冰箱中，筛选表达抗生素抗性基因的菌落。挑取 1 个生长良好的单菌落，接种到 5 ml 含 Amp 的 LB 液体培养基中，在 37 ℃恒温摇床上以 200 r/min 振荡培养，直至到达细菌的对数生长期（约 16 h），即600为 0.6 ～ 0.8。在含有菌液的冻存管中加入 20% 的甘油，于–80 ℃冰箱中冷冻保存。

1.2.4 IPTG诱导融合蛋白表达 取–80 ℃下保存的菌落 30 μl 接种到 3 ml 含 Amp 的 LB 液体培养基中，在 37 ℃恒温摇床上以 200 r/min 过夜振荡培养，直至到达细菌的对数生长期。将培养好的菌液于 4 ℃条件下，以 8000 r/min 的速度离心 10 min，弃掉上清，用 5 ml 含 Amp 的 LB 液体培养基重悬细菌，在 37 ℃恒温摇床上以 200 r/min 振荡培养 2 ～ 4 h，直至到达细菌的对数生长期。于菌液中加入 IPTG 至终浓度为 0.84 mmol/L，在 37 ℃恒温摇床上以 200 r/min 振荡培养 4 h 以诱导融合蛋白表达后，准确测定600值。在 4 ℃条件下，以 8000 r/min 离心 10 min 并收集菌体。

1.2.5 裂解细胞，提取融合蛋白 以菌液:溶菌酶结合缓冲液（冰浴的）= 20:1 的比例混和后，加入 PMSF（蛋白酶抑制剂）至终浓度为 1 mmol/L。以菌液:核酸酶（2 U/μl）= 10:1的比例加入相应单位的核酸酶。于冰上放置 30 min 后，使用超声裂解仪裂解细菌。具体方法为：裂解仪设置能量为 200 W，工作时间为裂解 1 s 停 1 s，循环为50 s，在 4 ℃条件下，将超声探头伸至菌液液面下约 0.5 cm 裂解细菌一个循环。将裂解后的菌液于 4 ℃，以 12 000 r/min 离心 10 min 后收集上清，于–20 ℃冰箱中冷冻保存。

1.2.6 纯化融合蛋白 用适量的 Ni-NTA 树脂填充柱，允许存储缓冲液通过重力流动从树脂中排出。通过将蛋白质提取物与等体积的平衡缓冲液混合来制备样品。用两个树脂床体积的平衡缓冲液平衡柱子，允许缓冲液从色谱柱中排出。将制备的蛋白质提取物加入树脂中，收集流出液，标注为流出物。用两个树脂床体积的洗涤缓冲液洗涤树脂，重复此步骤，直至 280 nm 处的流过部分的吸光度接近基线。用两个树脂床体积的洗脱缓冲液从树脂中洗去带 His 标签的蛋白质。重复这个步骤两次，每个部分在一个单独的管中，分别标注为洗脱 1 及洗脱 2。通过测量 280 nm 处级分的吸光度监测蛋白质洗脱。将收集的洗脱液依次加入 20 kD 及 10 kD 透析袋中进行透析浓缩，收集透析液。

1.2.7 SOD 融合蛋白鉴定 将上述所获得的上清液及纯化蛋白以体积比 4:1 加入 5 × SDSloading buffer，100 ℃煮 5 min，冷却离心后进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，部分凝胶进行考马斯亮蓝染色，部分凝胶应用半干式电转仪转至 PVDF 膜，5% 脱脂牛奶进行封闭 2 h，用 TBST 缓冲液将 His Tag 抗体以 1:1000 的体积比进行稀释，室温下孵育 PVDF 膜 1 h 后，4 ℃摇床过夜，TBST 缓冲液洗膜 15 min × 3次，TBST 按 1:30000 稀释的二抗（羊抗鼠），室温孵育 2 h，TBST 缓冲液洗膜 15 min × 3次，暗室曝光、定影、显影及扫描胶片，采用Image J 进行图像处理，反映目的蛋白的表达。

1.2.8 SOD 融合蛋白浓度及活性测定 按试剂盒说明书应用 BCA 法测定 SOD 融合蛋白浓度，应用 SOD 试剂盒检测 SOD 活性。

2 结果

2.1 SOD 融合蛋白原核重组表达载体的构建

经过限制性内切酶I、I 和I、HI 两次双酶切后，将 PTD4 与Cu,Zn-SOD 基因片段定向插入，成功构建了 PTD4-Cu,Zn-SOD 质粒，其长度为 6207 bp（图1A）。优化后的 SOD 融合蛋白质粒如图1B 所示，PTD4 序列前的I与I 限制性内切酶位点消失，最近的双切酶位点为I 与H I 位点。克隆/表达区域内，His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD 序列作为一个整体，在I 与HI 限制性内切酶作用下定向插入，构建了长度为 6213 bp 的优化质粒。测序结果与预先设计的序列对比，显示碱基序列正确。

2.2 SOD 融合蛋白重组质粒的基因序列

如图2 所示，阴影部分为定向插入的 His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD DNA 序列。

2.3 裂解菌液中 SOD 融合蛋白表达鉴定

如图3 所示，菌体裂解离心后上清液中有大量的目的蛋白表达，在最佳温度（37 ℃）及 IPTG 最佳诱导浓度（0.84 mmol/L）下，灰度扫描分析显示，表达量约占菌体总蛋白的 32%。未优化表达载体上清液中的目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的 20%[5]。

2.4 纯化SOD 融合蛋白表达鉴定

通过 SOD-PAGE 电泳、考马斯亮蓝染色鉴定 SOD 融合蛋白表达情况如图4 所示，Western blot 鉴定 SOD 融合蛋白结果如图5所示，结果提示，通过以上实验步骤，优化后的质粒能够表达 SOD 融合蛋白，分子量为 20 kD 左右，无明显杂带，灰度扫描分析显示纯度为 94%，证明蛋白纯化效果良好。未优化表达载体目的蛋白表达，灰度扫描显示纯度为 90%[5]。

图1 pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD 与 SOD 融合蛋白原核重组表达载体构建图[A：pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD 质粒；B：SOD 融合蛋白质粒图（优化后）]

Figure 1 Construction of recombinant expression vector of pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD and SOD fusion protein [A: pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD plasmid; B: SOD fusion protein plasmid(optimized)]

图2 SOD 融合蛋白原核重组表达载体基因序列（阴影部分为定向插入的 His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD DNA 序列）

Figure 2 Gene sequence of SOD fusion protein prokaryotic recombinant expression vector (The shaded part is the His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD DNA sequence inserted in the direction)

1：Marker（5 μl）；2 ～ 4：上清液（37 ℃，IPTG 终浓度 0.1、0.5、0.84 mmol/L，10 μl）；5 ～ 7：上清液（28 ℃，IPTG 终浓度 0.1、0.5、0.84 mmol/L，10 μl）；8 ～ 10：上清液（16 ℃，IPTG 终浓度 0.1、0.5、0.84 mmol/L，10 μl）

1: Marker (5 μl); 2 - 4: supernatant (37 ℃, IPTG final concentration 0.1, 0.5, 0.84 mmol/L, 10 μl); 5 - 7: supernatant (28 ℃, IPTG final concentration 0.1, 0.5, 0.84 mmol/L, 10 μl); 8 - 10: supernatant (16 ℃, IPTG final concentration 0.1, 0.5, 0.84 mmol/L, 10 μl)

图3 不同温度及 IPTG 不同诱导条件下，SOD 融合蛋白的分布

Figure 3 Distribution of SOD fusion protein under different temperature and IPTG induction conditions

1、6：Marker（8 μl）；2 ～ 3：洗脱液 1（10 μl）；4 ～ 5：洗脱液 2（10 μl）

1, 6: Marker (8 μl); 2 - 3: Eluted protein 1 (10 μl); 4 - 5: Eluted protein 2(10 μl)

图4 SOD 融合蛋白表达鉴定

Figure 4 Expression identification of SOD fusion protein

2.5 SOD 融合蛋白浓度及活力检测

BCA 法测定 SOD 融合蛋白浓度为 1.8 mg/ml，SOD 试剂盒检测 SOD 融合蛋白在 37 ℃时 SOD总活力为（3065.137 ± 19.75）U/mg prot。而未优化表达载体，目标蛋白浓度为 0.7 mg/ml，37 ℃时 SOD 总活力为（1125.888 ± 15.65）U/mg prot。

3 讨论

重组蛋白表达的过程包括将合适的互补 DNA（cDNA）序列插入表达载体（如质粒）中，然后通过转染、热激等方法将构建体引入宿主细胞系中，转录出翻译编码靶蛋白的mRNA，并在短时间内表达大量的目的蛋白。在宿主细胞选择方面，大肠杆菌以快速生长、高效接收外源 DNA 和高速率表达重组蛋白的特点，成为蛋白质生产的优选宿主[6]。本课题组前期利用 PTD4 肽高效的穿膜性，且能保证 SOD 活性的特点，采用 PTD4 与Cu,Zn-SOD 结合，以 pET16b 质粒为表达载体，运用基因工程成功获得了pET16b-PTD4-Cu, Zn-SOD 重组质粒[4]，并以BL21(DE3) 为宿主，利用蛋白纯化技术获得 PTD4-Cu,Zn-SOD 融合蛋白[5]，并成功将体外表达的Cu,Zn-SOD 递送入体外培养的人星形胶质细胞中[7]，克服了普通 SOD 穿膜困难的缺点。

由于每一种宿主都有自己的密码子偏好，使用宿主偏好的密码子有助于提高蛋白质表达的效率和准确性[8]，为了增加蛋白质的表达水平，密码子优化策略被广泛应用。密码子优化是指通过改变基因的密码子，克服与密码子使用相关的表达限制来使蛋白质表达最大化的方法。自然界的生物共用一套密码子，除 3 个终止密码子，余 61 个密码子可以编码出 20 种氨基酸，这表明大多数氨基酸由一个以上的同义密码子编码[9]，即不同的密码子可以编码同一种氨基酸，因此这种方法是可行的。密码子优化策略能够成功提高蛋白质表达水平的关键原因有：稀有密码子对蛋白质产生具有限速作用、同义密码子可互换而不影响蛋白质结构和功能以及通过用常用的密码子代替稀有密码子可以增加蛋白质的产生[10]。据报道，密码子优化可以使蛋白质表达增加 1000 倍[11]。前期的pET16b-PTD4- Cu,Zn-SOD 融合蛋白的Cu,Zn-SOD 序列来源于人，而宿主为大肠杆菌。在这种异源条件下，宿主细胞的环境完全不同，由于密码子偏好问题，导致宿主被迫表达其不具有丰富转运 RNA（tRNA）的目的蛋白，这也是对于不同来源的重组基因不能高水平表达的一个重要原因[12]。此次设计引物的序列末端带有 TAA，在I酶切位点插入后，可以保证蛋白的 N 端不会有多余的碱基序列，在I 酶切位点插入，His·Tag 前有 ATG，在使 SOD 融合蛋白载体上所带的His·Tag 表达的同时，没有增加多余的氨基酸，可达到纯化蛋白的目的。

图5 Western blot 鉴定（蛋白上样量均为 10 μl）

Figure 5 SOD fusion protein identification by Western blot (The amount of protein is 10 μl)

本实验充分考虑了物种密码子的使用偏差，根据密码子的简并性，采用大肠杆菌常用密码子并替换稀有密码子，优化 PTD4-Cu,Zn-SOD 碱基序列。本研究只针对碱基序列进行了优化，氨基酸的表达并未改变，且在表达载体中加入新的标签蛋白片段，可达到纯化蛋白的目的。本实验结果发现，优化后的重组表达载体基因测序结果与预先设计的序列对比，显示碱基序列正确。大肠杆菌菌体裂解离心后上清液中有大量的目的蛋白表达，在最佳温度（37 ℃）及 IPTG 最佳诱导浓度（0.84 mmol/L）下，灰度扫描分析显示，表达量约占菌体总蛋白的 32%，远高于前期实验上清液中 SOD 融合蛋白表达量（20%）。SOD-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色及Western blot 鉴定 SOD 融合蛋白结果提示，优化后的质粒能够表达 SOD 融合蛋白，分子量为 20 kD 左右，灰度分析显示纯度为 94%，无明显杂带，蛋白纯化效果良好，且明显高于前期实验中蛋白纯度（90%）。BCA 法测定 SOD 融合蛋白浓度为 1.8 mg/ml，SOD 试剂盒检测 SOD 融合蛋白在 37 ℃时 SOD 总活力为（3065.137 ± 19.75）U/mg prot，远高于前期实验中目的蛋白浓度（0.7 mg/ml）及活性（1125.888 ± 15.65）U/mg prot，均提示本实验合成的 SOD 融合蛋白具有高水平的浓度和活力，可为后期的抗氧化治疗提供可能的途径。

综上所述，通过重组表达载体密码子优化，可以获得高产量、高活性的 SOD 融合蛋白。

[1] Gump JM, Dowdy SF. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med, 2007, 13(10):443-448.

[2] Ho A, Schwarze SR, Mermelstein SJ, et al. Synthetic protein transduction domains: enhanced transduction potential in vitro and in vivo. Cancer Res, 2001, 61(2):474-477.

[3] Xie W, Le CY, Wang J, et al. Expression of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene in Escherichia coll. J Clin Rehabil Tissue Eng Res, 2008, 12(46):9181-9183. (in Chinese)

谢伟, 乐超银, 王健, 等. 重组人粒细胞集落刺激因子在大肠杆菌中的表达. 中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12(46):9181-9183.

[4] Dang SJ, Xue RL, Meng LH, et al. Construction of prokaryotic recombinant expression vector of PTD4-Cu, Zn-SOD. Chin J Anesthesiology, 2015, 35(4):486-489. (in Chinese)党沙杰, 薛荣亮, 孟丽华, 等. PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体的构建. 中华麻醉学杂志, 2015, 35(4):486-489.

[5] Dang SJ, Wei WB, Han LC, et al. Preparation of PTD4-Cu,Zn-SOD fusion protein. Chin J Anesthesiology, 2017, 37(8):939-942. (in Chinese)

党沙杰, 卫文博, 韩丽春, 等. PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白的制备. 中华麻醉学杂志, 2017, 37(8):939-942.

[6] Kaur J, Kumar A, Kaur J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. Int J Biol Macromol, 2018, 106:803-822.

[7] Meng LH, Xue RL, Yang YM, et al. Protein transduction domain 4-Cu, Zn superoxide dismutase fusion protein reduces hypoxic apoptosis in human astrocyte cultures. Int J Anesthesiolog Resuscitation, 2017, 38(8):682-687. (in Chinese)

孟丽华, 薛荣亮, 杨毅猛, 等. 蛋白质转导4型-铜锌超氧物歧化酶融合蛋白在人星形胶质细胞中穿膜能力和保护作用的研究. 国际麻醉学与复苏杂志, 2017, 38 (8):682-687.

[8] dos Reis M, Savva R, Wernisch L. Solving the riddle of codon usage preferences: a test for translational selection. Nucleic Acids Res, 2004, 32(17):5036-5044.

[9] Welch M, Villalobos A, Gustafsson C, et al. You're one in a googol: optimizing genes for protein expression. J R Soc Interface, 2009,6 Suppl 4 (Suppl 4):S467-476.

[10] Mauro VP. Codon optimization in the production of recombinant biotherapeutics: Potential risks and considerations. BioDrugs, 2018, 32(1):69-81.

[11] Gustafsson C, Minshull J, Govindarajan S, et al. Engineering genes for predictable protein expression. Protein Expr Purif, 2012, 83(1): 37-46.

[12] Fattahian Y, Riahi-Madvar A, Mirzaee R, et al. Optimization of in vitro refolding conditions of recombinant Lepidium draba peroxidase using design of experiments. Int J Biol Macromol, 2018, 118(Pt B): 1369-1376.

Optimization of PTD4-Cu,Zn-SOD protein recombinant expression vector and protein expression

CHENG Yan, WAN Ting-ting, XUE Rong-liang

Author Affiliations: Department of Anesthesiology, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi'an 710068, China (CHENG Yan); Anesthesia & Comfort Health Center, Xi’an International Medical Center Hospital, Shaanxi 710100, China (XUE Rong-liang); Department of Anesthesiology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China (WAN Ting-ting)

Optimization of PTD4-Cu,Zn-SOD protein recombinant expression vector to increase PTD4-Cu,Zn-SOD protein expression.PTD4-Cu,Zn-SOD prokaryotic recombinant expression vector were optimized and amplified, and the target genes were identified through designing primers and genetic engineering. The optimized vector was transformed intoBL21(DE3) by heat shock method and induced to express the protein by IPTG. After theBL21(DE3) cells were cracked by lysozyme & ultrasound, the supernatant was collected after centrifugation, and purified with Ni-NTA resin, followed by concentration with 10 kD and 20 kD dialysis bags to obtain the PTD4-Cu,Zn-SOD proteins. SDS-PAGE gel electrophoresis and Western blot were used to identify the protein. The concentration and vitality of PTD4-Cu,Zn-SOD proteins were determined by BCA and xanthine oxidase method.The rare bases in recombinant expression vector were optimized, and His-tag was added. The His-PTD4-Cu-SOD and His-PTD4-Zn-SOD sequence were inserted as a whole into the restriction site ofI andH I enzymes for construction. Theoptimized plasmid has a length of 6213 bp, and the base sequence was correct by gene sequencing. Optimized PTD4-Cu,Zn-SOD protein expression accounted for about 32% of the content in bacterial cells, which was higher than the original one (20%); and the protein purity after purification and concentration was 94%, which was higher than the original protein (90%). The concentration was 1.8 mg/ml, and total SOD activity at 37 ℃ was (3065.137 ± 19.75) U/mg protein.High yield and activity PTD4-Cu,Zn-SOD protein can be obtained through optimization of recombinant expression vector.

protein domain; superoxide dismutase; plasmid

XUE Rong-liang, Email: xuerl299@163.com

国家自然科学基金（81471131）

薛荣亮，Email：xuerl299@163.com

2020-12-15

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.004