HPLC法测定吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中主药的含量

李岩，郭晓茹，冯文凯，刘明亮，王丹，夏桂民

·论著·

HPLC法测定吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中主药的含量

李岩，郭晓茹，冯文凯，刘明亮，王丹，夏桂民

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所制剂室

建立吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中主药的含量测定方法。采用 HPLC 法检测吉西他滨氨基甲酸酯的含量。色谱条件：Inertsil ODS-SP 色谱柱（5 μm，150 mm × 4.6 mm），以磷酸盐缓冲液:甲醇（20:80）为流动相等度洗脱，流速1.0 ml/min，检测波长 243 nm，柱温 30℃，进样量 20 μl。色谱分离度= 3.363，阴性对照无干扰；吉西他滨氨基甲酸酯在5.81 ～ 150.00 μg/ml 范围内线性关系良好（= 0.9999）；低、中、高 3 种浓度的平均回收率分别为98.3%（RSD = 1.77%，n = 3）、100.0%（RSD = 0.24%，n = 3）、97.8%（RSD = 0.92%，n = 3）；日内精密度 RSD = 0.09%（n = 6），日间精密度 RSD = 1.36%（n = 18）；流速在 0.99 ～ 1.01 ml/min 范围内变化时 RSD = 1.02%（n = 9），柱温在28 ～ 32 ℃之间变化时 RSD = 0.27%（n = 9）。本文建立的方法简便易行、专属性强、重复性好、准确度高、耐用性好；可定量检测吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中主药的含量。

高效液相色谱； 含量测定； 吉西他滨氨基甲酸酯； 脂质体

吉西他滨是周期特异性抗代谢嘧啶核苷类似物，通过抑制 DNA 链的延长抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡[1-4]。吉西他滨是治疗胰腺癌的一线用药[5]，也常联合其他抗癌药物用于转移性乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌等[6]。自 1996 年美国 FDA 批准吉西他滨应用于临床以来[7]，目前仅有注射用冻干粉针剂一种剂型[8]。因吉西他滨易被脱氨酶降解失活，导致半衰期短（8 ～ 17 min），迫使吉西他滨的临床剂量较大（1000 mg/m2），由此常常带来诸多不良反应[3, 9]。

为了改善吉西他滨上述不足，经对其结构修饰，合成了新化合物吉西他滨氨基甲酸酯，并将其构建成纳米脂质体，以规避体内相关酶对其的酶解失活，延长药物半衰期，实现增效减毒。在此研究过程中，建立了吉西他滨氨基甲酸酯脂质体中主药的含量测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

LC - 20A 高效液相色谱仪、色谱柱（C18：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，5 μm，150 mm ×4.6 mm）均购自日本岛津公司；R-300 型旋转蒸发仪购自瑞士 Buchi 公司；XSE105 型分析天平购自瑞士梅特勒公司；KQ-250DB 型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；低温光照仪购自药物制剂国家研究中心。

吉西他滨氨基甲酸酯脂质体（以下简称“吉西氨脂”），自制（外观呈淡蓝色乳光，粒径约 90 nm，批号 200920、201101 ～ 05 共6 批）；工作对照品，批号 201908，99.0%，本所合成室提供；甲醇为色谱纯，购自美国 Fisher Scientific 公司；其他试剂均为市售色谱纯或分析纯。

1.2 方法

1.2.1 对照溶液 精密称取主药 2.50 mg，置于 50 ml 量瓶中，加甲醇少许，超声使其完全溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.2 供试品溶液及空白对照溶液 精密量取0.1 ml 吉西氨脂悬液，置于 2 ml 量瓶中，用甲醇定容至刻度，充分振荡、摇匀，4 ℃、12 000 ×条件下离心 10 min，上清液即为供试品溶液。另精密量取 0.1 ml 空白脂质体悬液，同法操作，得空白对照溶液。

1.2.3 检测法 以 Inertsil ODS-SP（5 μm，150 mm × 4.6 mm；十八烷基硅烷键合硅胶）为色谱柱；以pH（2.5 ± 0.1）磷酸盐缓冲液:甲醇（20:80）为流动相等度洗脱；检测波长为 243 nm；柱温为 30 ℃；进样体积为 20 μl。

1.2.4 系统适用性试验 分别取“1.2.1”和“1.2.2”项下对照溶液、供试品溶液及空白对照溶液适量，照“1.2.3”项下色谱条件操作，记录色谱图。

1.2.5 破坏性试验 分别取吉西氨脂悬液、空白脂质体悬液、对照溶液各 5 份，进行以下破坏性试验。

1.2.5.1 酸破坏 精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，加入 1 mol/L盐酸溶液 0.5 ml，室温下避光放置 12 h，按“1.2.2”项下方法操作，得酸破坏供试品溶液。同法操作，得酸破坏空白对照溶液及酸破坏对照溶液。

1.2.5.2 碱破坏 精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，向其中加入 1 mol/L氢氧化钠溶液 0.5 ml，余下同“1.2.5.1”，得碱破坏供试品溶液、碱破坏空白对照溶液及碱破坏对照溶液。

1.2.5.3 氧破坏 精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，向其中加入 3% 过氧化氢溶液 0.5 ml，室温下避光放置 3 h。按“1.2.2”项下方法操作，得氧破坏供试品溶液。同法操作，得氧破坏空白对照溶液及氧破坏对照溶液。

1.2.5.4 光破坏 精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，向其中加入 5% 葡萄糖溶液 0.5 ml，在低温光照仪［（4500 ± 500）lx］中照射 4 h。按“1.2.2”项下方法操作，得光破坏供试品溶液。同法操作，得光破坏空白对照溶液及光破坏对照溶液。

1.2.5.5 高温破坏 精密量取 2 ml 吉西氨脂悬液，向其中加入 5% 葡萄糖溶液 0.5 ml，在 65 ℃水浴中避光加热 8 h。按“1.2.2”项下方法操作，得高温破坏供试品溶液。同法操作，得高温破坏空白对照溶液及高温破坏对照溶液。

1.2.6 线性与范围 精密称取对照品适量，置于 50 ml 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，再用甲醇依次递倍稀释，得 8 种不同浓度的主药溶液（浓度范围为 5.81 ～ 150.00 μg/ml）。照“1.2.3”操作，记录峰面积。

1.2.7 检测限与定量限 精密量取吉西氨脂悬液适量，用 5% 葡萄糖溶液递倍稀释，照“1.2.2”处理样品，照“1.2.3”操作，记录色谱图，分别以信噪比为 3:1 和 10:1 时相应的主药的量为检测限和定量限。

1.2.8 重复性试验 取同一供试品 6 份，照“1.2.3”操作，记录峰面积。

1.2.9 精密度试验 取同一供试品，照“1.2.3”操作，同一天内连续进样 6 次，记录峰面积。另取同一份供试品，连续 6 天，每天同法操作，记录峰面积。

1.2.10 回收率试验 精密称取主药 5.50、5.00、4.50 mg 各3 份，分别置于 50 ml 量瓶中，加甲醇适量并超声使其完全溶解，再加空白脂质体悬液 5 ml，用甲醇定容至刻度，摇匀，4 ℃、12 000 ×条件下离心 10 min，得低、中、高3 种不同浓度的供试品溶液。照“1.2.3”项下条件，分别进样，记录色谱图，按外标法计算得主药浓度，再与理论值对比，每个浓度平行测定 3 次，得平均回收率。

1.2.11 耐用性试验

1.2.11.1 流速变化的影响 将流速分别设置为 0.99、1.00、1.01 ml/min，取同一供试品溶液，照“1.2.3”项下条件，记录峰面积。

1：吉西他滨氨基甲酸酯；a：吉西氨脂；b：溶媒；c：空白脂质体；d：对照溶液

1: Carbamate-gemcitabine; a: Gemcitabine carbamate-loaded liposomes; b: Solvent; c: Blank liposomes; d: Carbamate-gemcitabine reference substance

图1 系统适用性色谱图

Figure 1 Chromatograms of system suitability

1.2.11.2 柱温对系统的影响 将柱温分别设置为 28、30、32 ℃，取同一供试品溶液，照“1.2.3”项下条件，记录峰面积。

1.2.12 含量测定 取连续5 批吉西氨脂，分别按“1.2.2”及“1.2.3”操作，记录色谱图，照外标法计算各批次供试品中主药的浓度。

2 结果

2.1 系统适用性

在对照溶液及供试品溶液中，主药的保留时间均约为 11.323 min，分离度均为 3.363。空白脂质体色谱图中相应保留时间处未见吸收峰（图 1）。上述结果表明在已建立的色谱条件下，吉西氨脂的辅料对主药的分析检测无干扰。

A B C D E F

1：吉西他滨氨基甲酸酯；a：空白脂质体；b：吉西氨脂；c：对照溶液

1: Carbamate-gemcitabine; a: Blank liposomes; b: Gemcitabine carbamate-loaded liposomes; c: Carbamate-gemcitabine reference substance

图2 破坏性试验色谱图（A：酸破坏；B：碱破坏；C：氧破坏；D：光破坏；E：高温破坏；F：未破坏）

Figure 2 Typical chromatograms of destructive test [Destruction by acid (A); by base (B); by oxidation (C); by illumination (D); by high temperature (E); nondestruction (F)]

2.2 专属性

分别取各待测破坏溶液，照“1.2.3”项下条件进样，记录色谱图（图 2）。结果表明，吉西他滨氨基甲酸酯色谱峰与酸、碱、光、高温破坏产生的降解产物色谱峰均能有效分离，说明本方法专属性良好。氧破坏试验组均未检测出吉西他滨氨基甲酸酯色谱峰，表明其对氧不稳定。

2.3 线性与范围

以主药峰面积 A 为纵坐标、浓度 C 为横坐标进行线性回归，得回归方程：A = 34569 C + 22727，= 0.9999。说明在 5.81 ～ 150.00 μg/ml 范围内主药浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 检测限与定量限

经检测，主药的检测限为 5.2 ng（S/N = 3），定量限为 16.8 ng（S/N = 10）。

2.5 重复性

取同一供试品 6 份，照“1.2.3”操作，经统计，重复性实验的 RSD = 1.39%（n = 6）（表1）。

2.6 精密度

经统计日内精密度 RSD 为 0.09%（n = 6），日间精密度 RSD 为1.36%（n = 18）（表2 和表3）。

表1 重复性试验结果

表2 日内精密度

2.7 回收率

统计求得低、中、高 3 个加样平均回收率为98.3%（RSD = 1.77%，n = 3）、100.0%（RSD = 0.24%，n = 3）和 97.8%（RSD = 0.92%，n = 3）（表4）。

2.8 耐用性

流速在 0.99 ～ 1.01 ml/min范围内变化时，RSD 为 1.02%（n = 9），说明该方法的耐用性良好（表5）。柱温在 28 ～ 32 ℃之间变化时，RSD 为0.27%（n = 9），说明此条件下对主药含量测定结果影响较小。

表3 日间精密度

表4 回收率试验结果

表5 耐用性试验结果

表6 5 批吉西氨脂含量测定结果

2.9 含量测定

5 批供试品含量测定结果见表6。

3 讨论

建立了 HPLC 法用于吉西氨脂中主药含量的测定，通过系统的方法学研究与验证，认为本法操作简便、专属性好、准确度高，适合于吉西氨脂中主药的含量测定。

3.1 药物稳定性的影响因素

破坏性试验结果提示，吉西他滨氨基甲酸酯在酸（pH 1盐酸溶液，12 h）、碱（pH 13氢氧化钠溶液，12 h）、光照（4500 ± 500 lx，4 h）、高温（65 ℃，8 h）条件下，未检测出主药色谱峰，说明主药被完全破坏。但吉西氨脂在上述酸、碱、光照、高温条件下，均能检测出主药色谱峰，并且能够与所产生的降解产物色谱峰有效分离，表明脂质体能提高吉西他滨氨基甲酸酯在酸、碱、光照、高温条件下的稳定性。同时，在已建立的色谱条件下，本方法专属性良好。

3.2 色谱条件的选择

本课题组制备了一系列吉西他滨衍生物，参照前期确定的梯度洗脱色谱条件，发现主药峰与杂质峰不能完全分离，分离度仅为 1.12（< 1.5），为了实现杂质与主药的有效分离，本研究尝试改变流动相比例，最终发现磷酸缓冲盐:甲醇（pH 2.4 ～ 2.5）= 20:80 等度洗脱时，主药峰与杂质峰能够有效分离，峰形对称，分离度为 3.363，保留时间适宜（11.323 min）。本研究在现有方法的基础上，改进并建立了更加简便、准确的色谱分析条件。

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Determination of the principal agent in gemcitabine carbamate-loaded liposomes by HPLC

LI Yan, GUO Xiao-ru, FENG Wen-kai, LIU Ming-liang, WANG Dan, XIA Gui-min

Author Affiliation: Pharmaceutics Department, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To establish an HPLC method for the quantification of the principal agent in gemcitabine carbamate-loaded liposomes.The separation was performed on an Inertsil ODS-SP column (5 μm, 150 mm × 4.6 mm) at 243 nm. The mobile phase consisted of sodium dihydrogen phosphate solution–methanol (20:80) at the flow rate of 1.0 ml/min. The column temperature was30 ℃ and the injection volume was 20 μl.The method was validated with a resolution of 3.363, linear in the range of 5.81 - 150.00 μg/ml (= 0.9999) and accurate. The average recovery rate was 98.3% (RSD = 1.77%, n = 3), 100.0% (RSD = 0.24%, n = 3) and 97.8% (RSD = 0.92%, n = 3) at low, medium and high concentrations, respectively. The precision, intra-day and inter-day precision reflected by the relative standard deviation (RSD) values was 0.09% (n = 6) and 1.36% (n = 18), respectively. The method is robust under slight changes of flow rate (0.99 - 1.01 ml/min) and column temperature (28 - 32 ℃) with RSD of 1.02% (n = 9) and 0.27% (n = 9), respectively.A simple, robust, accurate HPLC method is established for the determination of the principal agent in gemcitabine carbamate-loaded liposomes.

HPLC; determination; gemcitabine carbamate; liposome

XIA Gui-min, Email: xiaguimin@126.com

国家重点研发计划（2016YFA0201504）；国家自然科学基金（81673383、81803479）

夏桂民，Email：xiaguimin@126.com

2020-12-21

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.003