利用生物信息学分析开发luminal型乳腺癌自噬相关基因预后模型

汤倩倩，邵尤城，魏蕾，张京伟

论著·

利用生物信息学分析开发luminal型乳腺癌自噬相关基因预后模型

汤倩倩，邵尤城，魏蕾，张京伟

430071 湖北，武汉大学中南医院甲状腺乳腺外科（汤倩倩、张京伟），医学院病理生理学教研室（邵尤城、魏蕾）

建立基于大规模自噬相关基因的 luminal 型乳腺癌预后预测模型。利用 TCGA 数据库乳腺癌数据，分别筛选 luminal 型与非 luminal 型乳腺癌、癌旁组织中差异表达的自噬相关基因。单因素和多因素 Cox 回归建立 luminal 型乳腺癌自噬相关基因预后模型。Kaplan-Meier 曲线和生存依赖的受试者工作特征曲线评估预后模型的准确性。基于差异表达自噬相关基因，建立了一个 3 基因（BAG1、CD46、DIRAS3）预后模型预测 luminal 型乳腺癌患者总生存期。3 年、5 年和 10 年的曲线下面积分别为 0.708、0.752 和 0.837。3 基因预后模型可以有效预测 luminal 型乳腺癌患者预后，或许今后可为 luminal 型乳腺癌的临床治疗提供决策依据。

luminal 型乳腺癌； 内分泌耐药； 自噬； 预后模型

在美国，女性乳腺癌发病率每年仅以 0.3% 的速率增加，且其死亡率在持续下降，已次于肺癌[1]。然而，在中国乳腺癌发病率和死亡率却在逐年上升[2]。从全球的角度来看，乳腺癌的高发病率和高死亡率仍然居高不下[3]。乳腺癌的肿瘤发生和治疗是高度异质性的，探索乳腺癌的分子机制，特别是分子亚型已成为乳腺癌研究的核心。目前临床广泛使用的乳腺癌分子分型为：luminal A（ER+和/或 PR+，HER2−）；luminal B（ER+和/或 PR+，HER2+）；her2（ER−，PR−，HER2+）和三阴性（ER−，PR−，HER2−）[4-6]。其中，luminal 型乳腺癌（luminal A 和 luminal B）占乳腺癌的大多数[7]。目前，内分泌治疗是 luminal 型乳腺癌有效的治疗策略。然而，内分泌治疗耐药现象十分常见，在临床实践中占 20% ～ 30%[8]。此外，研究表明，在完成 5 年的辅助内分泌治疗后，乳腺癌复发的风险持续 15 年[9]。内分泌抵抗机制的研究已经有了突破，针对其中一些机制的靶向抑制剂已经合成并用于临床治疗[10]，然而靶向抑制剂的耐药仍然不可避免[11]。因此，探索治疗内分泌抵抗的新分子靶点迫在眉睫。

自噬，是一高度保守的分解代谢过程，在各种机体过程中起重要作用，如发育和衰老[12]，而异常自噬与包括肿瘤在内的许多疾病的发生发展密切相关[13-14]。越来越多的证据表明，自噬在各种癌症（包括腔内乳腺癌）的治疗耐药性反应中起着关键作用[15-16]。对内分泌疗法的抵抗是导致 luminal 型乳腺癌幸存者疾病复发的主要原因。目前尚无基于大规模自噬相关基因的预后模型。因此，本研究旨在通过鉴定差异表达的自噬相关基因（ATGs），建立一种新的预后模型预测 luminal 型乳腺癌患者的预后。

1 材料与方法

1.1 数据获取和预处理

从人自噬数据库（HADB）（http://www. autophagy.lu/）下载共 232 个自噬基因。1109例乳腺癌样本和 113 例癌旁样本的 RNA-seq 表达数据从 TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）下载。乳腺癌临床资料从 UCSC Xena 数据库（http://xena.ucsc.edu/public）下载。排除临床病理资料（包括 TNM 分期和病理分期）缺失或不明确，ER、PR、HER2 状态不确定和或OS 为零的样本。依据 TCGA 免疫组化检测，对纳入的临床样本进行分型。最终，共 507 例 luminal 型乳腺癌、113 例癌旁组织和 133 例非 luminal 型乳腺癌被纳入本研究。通过 R 语言包分析基因表达数据与相应临床特征信息的相关性。

1.2 方法

1.2.1 差异表达 ATGs 的识别 采用 Limma 软件包分别筛选 luminal 型乳腺癌和癌旁、非luminal 型乳腺癌样本间表达差异的 ATGs。此外，使用 Venn plot 工具包（http://www.funrich.org/）分析和可视化对照组的交集。采用 wilcox 秩和检验和 fold change（FC）方法鉴定差异表达的 ATGs，截断值< 0.05 且|log FC| > 0.5[17-18]。

1.2.2 功能富集分析 使用“聚类分析器软件包”进行基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。GO 由分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞成分（CC）组成。通路富集分析整合自 KEGG，分别选取 GO 和 KEGG 的前 30 条富集途径。< 0.05 被认为统计学相关。

1.2.3 ATGs 相关预后模型的构建 合并 507 例luminal 型乳腺癌患者的临床病理资料及相应31 个 ATGs 差异表达资料。采用单变量 Cox 比例风险回归模型，从 luminal 型乳腺癌患者 31 个差异表达的 ATGs 中鉴定 OS 相关基因。经单变量分析，OS 相关性有统计学意义的 ATGs 进一步纳入多变量 Cox 回归分析。设定阈值< 0.05，最终得到 3 个具有显著预后价值的 ATGs 并建立了风险评分公式。风险评分公式由 3 个差异表达的ATGs 的积分，加权各自的单变量 Cox 回归系数产生。根据风险评分公式，以中位风险评分作为分界点，将每位 luminal 型乳腺癌患者分为低风险和高风险组。采用 Kaplan-Meier 分析和 log-rank 检验比较高、低风险组间患者 OS 的差异。随后，进行单变量和多变量 Cox 回归分析，确认风险评分系统在调整其他临床变量后的预后意义。使用生存依赖的受试者工作特征（ROC）曲线来评估预后模型的敏感性和特异性。

1.3 统计学处理

采用单因素和多因素 Cox 回归确定预后因素并建立风险评分公式。采用 Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，并采用 log 秩检验进行比较。ROC 曲线用于评估预后特征的预测能力。所有统计分析都使用 R 语言（3.6.2版本）进行。双侧检验< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达 ATGs 的鉴定

数据预处理后，纳入 507 例 luminal 型乳腺癌标本、133 例非 luminal 型乳腺癌标本和 113 例癌旁标本的 RNA-seq 数据。507 例 luminal 型乳腺癌患者和 133 例非 luminal 型乳腺癌患者的临床特征见表1。热图和火山图（图1A）显示 88 个ATGs 在 luminal 型乳腺癌和癌旁样本之间差异表达，其中红点代表显著上调基因，绿点代表显著下调基因，黑点代表无差异基因。图1B 显示了 luminal 型和非 luminal 型乳腺癌样本差异表达的 57 个ATGs。韦恩图（图2A、B）显示 31 个 ATGs在两次比较中均有差异。31 个差异表达的 ATGs 中，CD46、BAG1、RPS6KB1、IKBKB、ATG16L1、PRKCD、VMP1、IL24、PTK6 在 luminal 型乳腺癌中的表达量高于非 luminal 型乳腺癌和癌旁组织，而 NRG2、CX3CL1、EGFR、TMEM74、CCL2、MYC、PRKCQ、ITGA6、ITGB4 在 luminal 型乳腺癌中表达最低。VEGFA、ERO1A、GAPDH、BAK1、CXCR4、EIF4EBP1、CDKN2A 和 BIRC5 在 luminal 型乳腺癌中的表达水平高于癌旁样本，但低于非 luminal 型乳腺癌样本。另外 5 个ATGs（DIRAS3、TP63、FOS、ITPR1、BNIP3L）在癌旁组织中表达量最高，其次是 luminal 型和非 luminal 型乳腺癌样本。箱线图（图2C、D）显示了 31 个差异表达 ATGs 的表达模式。

表1 luminal 型和非 luminal 型乳腺癌患者的临床病理特征

图1 差异表达的 ATGs 热图及火山图（A：Luminal 型乳腺癌与癌旁组织间差异表达的88个 ATGs；B：Luminal 型与非 luminal 型乳腺癌间差异表达的 57个ATGs；L：Luminal 型乳腺癌；N：癌旁组织；nL：非 luminal 型乳腺癌）

Figure 1 The heatmap plot and volcano plot of differentially expressed ATGs (A: 88 differentially expressed ATGs between luminal and cancer-adjacent tissues; B: 57 differentially expressed ATGs between luminal and non-luminal breast cancers samples; L: Luminal breast cancers; N: Cancer-adjacent tissues; nL: Non-luminal breast cancers)

2.2 差异表达的 ATGs 功能富集

对 31 个差异表达 ATGs 进行 GO 和 KEGG前 30 条通路富集分析。结果显示，GO 分析（图3A）中基因显著富集与 BP 包括丝氨酸肽基改变、老化、氧化应激反应、应对缺氧反应、对氧水平的反应以及调节细胞间的黏附相关，在 CC 中包括自噬体膜和自噬体，而在 MF 中包括蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性，受体配体活性和细胞因子活性；KEGG 通路主要集中在人巨细胞病毒感染、人类乳头瘤病毒感染、PI3K-Akt 信号通路以及 microRNA 在癌症、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和膀胱癌中的作用（图3B）。

Figure 2 The venn plot of differentially expressed ATGs (A: Between luminal breast cancer and cancer-adjacent tissues; B: Between luminal and non-luminal breast cancers) and expression profile of 31 differentially expressed ATGs between luminal breast cancers and cancer-adjacent tissues (C) and between luminal and non-luminal breast cancer samples (D) (NandL: Luminal breast cancers versus paracancer tissues; nLandL: Luminal versus non-luminal breast cancer tissue; down: Down-regulated; up: Up-regulated; Each red box, green and blue plot represent a different luminal breast cancer and a cancer-adjacent sample, a non-luminal breast cancer sample, respectively)

Figure 3 GO (A) and KEGG (B) analysis of 31 differentially expressed ATGs (The node color changes gradually from red to blue in ascending order according to thevalues, the size of the node represents the number of counts)

2.3 预后模型的构建和验证

将 507 例 luminal 型乳腺癌患者的临床病理数据与 31 个差异表达的 ATGs 数据合并后采用Cox 回归模型进行单因素分析，发现 5 个 ATGs（BAG1、CD46、DIRAS3、IL24、TP63）影响 luminal 型乳腺癌预后。森林图表明除了 CD46，BAG1、DIRAS3、IL24 和 TP63 均是保护因子（图4A）。接着对这 5 个候选基因进行多因素 Cox 回归分析，筛选出 3 个 ATGs（BAG1、CD46、DIRAS3）与 luminal 型乳腺癌患者 OS 显著相关（图4B）。整合 3 个基因并加权各自的多变量 Cox 回归系数后，得到风险评分公式：（–0.7392 × BAG1 的表达值）+（0.7126 × CD46 的表达值）+（–0.2802 × DIRAS3 的表达值）。根据风险评分公式，507 例 luminal 型乳腺癌患者被赋予一个危险值，并以中位危险值作为截断值，被划分为高危组（253 例）和低危组（254 例）。将分组结果用预后特征分布图（图5A）、患者生存状况图（图6B）、3 个 ATGs 表达谱热图（图5C）和生存曲线图（图5D）可视化。Kaplan-miere 生存曲线表明高风险组的生存率明显低于低风险组（= 4.576e-05）。此外，调整其他临床变量如年龄、TNM 分期、病理分级、ER、PR 和 HER2 之后，单因素和多因素 Cox 回归分析均表明，预后指数是 luminal 型乳腺癌患者的独立预后指标（HR = 1.335，95%CI = 1.133 ～ 1.573；< 0.001）（图6A、B）。3 年、5 年和 10 年曲线下面积（）分别为 0.708、0.752 和0.837（图6C）。以上研究结果表明该预后模型具有一定的生存预测潜力。

2.4 预后模型的临床相关性分析

风险评分的相关性公式与临床病理的特点及其预后意义分析结果表明，风险评分与腔内乳腺癌T 分期（= 0.003）、N 分期（= 0.029）和病理分级（= 1.537E-04）显著相关（图7）。

3 讨论

内分泌抵抗在 luminal 型乳腺癌的治疗中仍然是一个挑战。尽管一些内分泌抵抗机制已明确，且针对某些机制一些靶向抑制剂已经用于临床并取得一定疗效，然而对靶向抑制剂耐药仍无法避免。因此，探索和验证 luminal 型乳腺癌细胞新的分子靶点治疗是非常有必要的。目前，越来越多的证据表明异常的自噬在 luminal 型乳腺癌抵抗内分泌治疗反应中扮演关键角色。自噬的调控过程是由一系列自噬相关基因控制的[19]。自噬相关基因的遗传畸变可引起多种疾病，包括乳腺癌[20-21]。已有研究利用大规模 ATGs 表达谱来筛选和识别预测乳腺癌预后的分子标记。比如，Gu 等[22]基于 GEO 数据库中的乳腺癌数据，分析 TP53 基因突变与非突变乳腺癌患者自噬相关基因的差异，建立并验证了预后模型；Lin 等[23]基于乳腺癌自噬相关基因分析，开发了一种预后指标。然而，目前尚无基于大规模自噬基因探索 luminal 型乳腺癌自噬相关基因的报道。因此，开发 luminal 型乳腺癌自噬相关基因风险评分系统显得十分必要。

图4 单因素（A）和多因素（B）Cox 回归分析评估 luminal 型乳腺癌患者 31 个 ATGs 表达水平与总生存率之间的关系

Figure 4 Univariate (A) and multivariate (B) Cox regression assesses relationship between expression levels of 31 ATGs and overall survival in patients with luminal breast cancers

图5 预后模型分布图（A）、各组患者生存状态图（B）、3 个 ATGs 的表达热图（C）和高低风险组 Kaplan-Meier 曲线图（D）

Figure 5 Distribution of prognostic index (A), survival status of patients in different groups (B), heatmap plot of the expression profile of 3 ATGs (C) and the distribution of Kaplan-Meier curves of different subgroups (D)

利用 TCGA 数据库乳腺癌数据，分别筛选了 luminal 型和非 luminal 型乳腺癌、癌旁组织间表达差异的 ATGs。取两比较组差异表达的 ATGs 的交集后，31 个差异表达的 ATGs 被纳入预后模型构建。通过单因素和多因素 Cox 回归分析，确定了 3 个预后相关基因（BAG1、CD46、DIRAS3）。通过整合 3 个 ATGs 并对其单变量 Cox 回归系数进行加权，得出风险评分公式。应用 ROC 曲线分析和 Kaplan-Meier 曲线评价预测模型预测 luminal 型乳腺癌患者总生存率的准确性。结果表明，风险评分公式可以有效地预测腔内乳腺癌患者的预后。风险评分公式中包含的 3 个 ATGs 与乳腺癌预后密切相关。BAG1，bcl2 相关的致癌基因是一种多功能抗凋亡蛋白，也是 21 个基因检测复发评分中 16 个肿瘤相关基因之一[24]。与之前的研究[25-26]一致，在我们的研究中，BAG1 在乳腺癌中高表达且预后更佳。Lu 等[27]发现 BAG1 下调可通过激活 PI3K/Akt/mTOR 信号通路诱导他莫西芬耐药。矛盾的是，尽管 BAG1 在不同亚型乳腺癌细胞中也被发现上调，Kizilboga 等[28]发现 BAG1 可以通过促进 Raf 和 Akt 的磷酸化来抑制乳腺癌细胞的凋亡。CD46，补体调节蛋白，可以保护宿主细胞免受自身补体的攻击。这种逃避免疫攻击的机制贯穿于肿瘤的发生、分化、转移过程中，对肿瘤的预后起着重要的作用。Cui 等[29]发现，HBXIP 可以通过 p-ERK1/2/NF-κB 信号通路上调 CD46，从而保护乳腺癌细胞免受补体的攻击。与 Maciejczyk 等[30]的研究一致，CD46 在纳入的 507 位 luminal 型乳腺癌患者中充当癌基因。DIRAS3，母系遗传的 ras 超家族成员之一，被认为是一个肿瘤抑制基因[31]。有研究表明，DIRAS3 在 60% 的卵巢癌和乳腺癌中被下调[32]。同样，我们的结果显示，与癌旁正常组织相比，DIRAS3 在乳腺癌组织中的表达更低。此外，我们还发现 DIRAS3 在 luminal 型乳腺癌中的表达高于非 luminal 型乳腺癌。Zou等[33]发现乳腺癌细胞中 DIRAS3 的表达可诱导自噬，促进紫杉醇对乳腺癌细胞的抑制作用。目前为止，关于上述 3 个自噬相关基因对 luminal 型乳腺癌预后影响及相关机制的研究较少。深入研究其相关作用机制是课题组今后努力的方向。

图6 单因素（A）和多因素（B）Cox 回归分析的森林图以及预测模型预测 3年、5 年和 10年总生存率的 ROC 曲线（C）

Figure 6 Forest plots of univariate (A) and multivariate (B) Cox regression analysis in luminal breast cancers and ROC curves of the signature predicting the 3- and 5- and 10- year overall survival rate (C)

图7 T 分期（A）、N 分期（B）和病理分级（C）与预测模型相关性具统计学差异

Figure 7values were statistically significant at tumor size (A), lymph node metastasis (B) and pathologic stage (C)

据目前所知，我们的研究是第一个基于大规模 ATGs 表达谱建立 luminal 型乳腺癌预后模型的研究。在方法学上，我们通过分别筛选 luminal 型与非 luminal 型乳腺癌、癌旁组织中表达差异的 ATGs 后，将两组均差异表达的 ATGs 作为 luminal 型乳腺癌差异表达的 ATGs 纳入模型构建，这可能有助于提高模型的准确度。此外，本研究提示 3 基因风险评分系统可以有效预测患者的 OS，这可能为今后的临床治疗提供依据。

然而，我们的研究仍然存在一些不足。首先，我们的数据来自于 TCGA 数据库，由于临床数据不完整及模棱两可，大部分样本被排除在外，这可能会造成选择偏倚。其次，在方法上，最好使用其他数据库数据进行外部验证。最后，我们还需要进一步的实验研究来阐明 3 个 ATGs 在 luminal 型乳腺癌中的功能和预测价值。

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Development of a prognostic model of autophagy-related genes in luminal breast cancers using bioinformatics analysis

TANG Qian-qian, SHAO You-cheng, WEI Lei, ZHANG Jing-wei

Author Affiliation: Department of Breast and Thyroid Surgery, Zhongnan Hospital (TANG Qian-qian, ZHANG Jing-wei), Department of Pathology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences (SHAO You-cheng, WEI Lei), Wuhan University, Hubei 430071, China

To establish a prognostic model for luminal breast cancer based on large-scale autophagy-related genes.Weidentified the differentially expressed autophagy-related genes among luminal and non-luminal breast cancers, cancer-adjacent tissues using breast cancer cohort from TCGA database, respectively. Subsequently, univariate and multivariate Cox regression were used to establish a prognostic model for luminal breast cancers based on differentially expressed autophagy-related genes. The accuracy of the prognostic model was evaluated with Kaplan-Meier curve and survival-dependent receiver operating characteristic (ROC) curves.31 differentially expressed autophagy-related genes in luminal breast cancers were identified. A three-gene (BAG1, CD46, DIRAS3) prognostic model was established to predict the overall survival (OS) of patients with luminal breast cancer. Furthermore, the area under the curve () at 3-, 5- and 10- years were 0.708, 0.752 and 0.837, respectively.The three-gene prognostic model can effectively predict the prognosis of patients with luminal breast cancer, and may provide decision-making basis for clinical treatment of luminal breast cancers in the future.

luminal breast cancers; endocrine resistance; autophagy; prognostic model

ZHANG Jing-wei, Email: zjwzhang68@whu.edu.cn

张京伟，Email：zjwzhang68@whu.edu.cn

2020-11-05

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.006