蒙顶黄芽水溶性成分LC-TOF/MS指纹图谱及定量分析

刘 晓,张 厅,唐晓波,马伟伟,王小萍,李春华,王 云

(四川省农业科学院茶叶研究所,四川成都 610066)

黄茶是我国六大茶类之一,是一类小众茶,为我国所独有。按鲜叶原料老嫩可分为黄芽茶、黄小茶和黄大茶三类。其中蒙顶黄芽是黄芽茶中的精品,自古以来都是宫廷贡茶,产于四川省雅安市名山区蒙顶山茶区。黄芽具有干茶黄、汤色黄、叶底黄的特点,并有抗氧化[1]、助消化[2]、抑制肝损伤[3-4]等多种保健功能。蒙顶黄芽有着独特的闷黄工艺及口感[5],受到越来越多消费者的青睐,产销量持续增长,黄茶产业日渐壮大。蒙顶黄芽的相关研究也越来越引人关注。目前,蒙顶黄芽的研究主要集中在加工工艺[6-10]、品质化学成分[11-16]、微生物动态变化规律[17-18]、生物学功能[19-20]等,但对黄茶水溶性成分的定量分析和采用水溶性成分进行黄茶的鉴别研究较少。而且,对黄茶鉴别和品质评判多依赖于感官评价,缺少能够量化的指标。

表1 供试蒙顶黄芽样品的来源信息Table 1 Sources of Mengding yellow bud samples used in this study

本研究搜集四川24个典型蒙顶黄芽样品,采用LC-TOF/MS指纹图谱及定量分析蒙顶黄芽水溶性成分,研究蒙顶黄芽的典型加工工艺特征,并进一步利用聚类分析对蒙顶黄芽样品进行分类,有助于构建系统科学的标准化蒙顶黄芽品质评价体系,为蒙顶黄芽的鉴别提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

24个(S1～S24)蒙顶黄芽样品 源自四川省的24个不同生产厂家,所有茶叶样品的生产年份均为2019年3月,详见表1,这24个茶样有没经过闷黄的,有用陈茶炒黄的,有传统工艺闷黄的,还有采用现代工艺闷黄的;考马斯亮蓝 G-250、95%乙醇、磷酸、浓硫酸、无水葡萄糖、无水碳酸钠、无水磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、茚三酮、乙二胺四乙酸二钠、抗坏血酸 成都科龙化工试剂厂;牛血清白蛋白、蒽酮、福林酚 分析纯,美国Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲酸、甲醇 色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司;乙酸 成都科龙化工试剂厂;标准品:没食子酸(纯度≥98%)、表儿茶素(纯度≥98%)、表没食子儿茶素(纯度≥98%)、表儿茶素没食子酸酯(纯度≥98%)、儿茶素没食子酸酯(纯度≥98%)、没食子儿茶素没食子酸酯(纯度≥98%) 美国Sigma-Aldrich公司;儿茶素(纯度≥98.67)、表没食子儿茶素没食子酸酯(纯度≥99.61%)、没食子儿茶素(纯度≥99.5%) 国家标准物质中心;L-谷氨酸(纯度≥99%) 日本TCI公司;咖啡碱(纯度≥98%) 中国食品药品检定研究院。

1260型液相色谱仪 美国Agilent公司;1200/6210 型液相色谱-飞行时间质谱联用仪 美国Agilent公司;JA2003型电子天平(精度:0.00001 g) 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;HH-6型数显恒温水浴锅 常州市金坛友联仪器研究所;UV-1700型紫外可见分光光度计 日本岛津公司;5810R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;BP 211D型电子天平 德国Sartorius公司;Milli-Q型超纯水器 美国Millipore公司;KH-500DE型数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;XW-80A型漩涡混合器 上海驰唐实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 感官审评方式 感官审评根据茶叶感官审评方法[21]黄茶标准进行。由5名国家二级评茶员以上资质的茶叶审评专家组成审评小组,审评得分为5人评分的平均值,审评术语由主评综合5人结果给出最后评语。其中外形占25%,汤色占10%,香气占25%,滋味占30%,叶底占10%。

1.2.2 可溶性蛋白质的测定 参考刘小华等的方法,采用考马斯亮蓝G-250比色法[22]法进行测定。

1.2.3 可溶性糖的测定 参照张正竹[23]主编《茶叶生物化学实验教程》中“实验2-6”进行测定。

1.2.4 茶多酚含量测定 参照GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[24]进行测定。

1.2.5 游离氨基酸酸总量测定 参照GB/T 8314-2013《茶 游离氨基酸总量的测定》[25]进行测定。

1.2.6 儿茶素组分和咖啡碱含量的测定 参照GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[24]的前处理方法进行制备供试液,并按照如下液相色谱条件进行测定:

液相色谱柱:Gemini® 5 μm C18 110 A,250 mm×4.6 mm;流动相A为0.1%乙酸水溶液,流动相B为乙腈,检测波长278 nm,柱温25 ℃,流速1.0 mL/min,进样量10 μL。梯度洗脱方法见表2:

表2 流动相的梯度洗脱程序Table 2 Mobile phase gradient elution procedure

1.2.7 指纹图谱的测定 准确称取0.2 g粉碎茶样于50 mL具塞离心管中,加入20 mL 90 ℃的蒸馏水,立即放入90 ℃水浴中浸提20 min,每隔5 min涡旋振荡10 s。提取完成后,静置,冷却至室温,取1 mL上层清液于12000 r/min下离心8 min,供LC-TOF MS测定。

LC-TOF/MS测定色谱条件:

液相色谱柱:Agilent XDB-C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);流动相:A为0.1%甲酸水溶液,B为乙腈;流速:0.2 mL/min;柱温:30 ℃;进样量:5 μL。

LC-TOF/MS测定质谱条件:

离子源:电喷雾离子源,正离子模式;雾化器压力:40 psi;毛细管电压:3500 V;干燥气流量:10 L/min;干燥气温度:350 ℃;除液电压:65 V;锥孔电压:120 V;扫描方式:全扫描。

1.3 数据分析

采用Excel 2010进行实验数据处理与标准曲线绘制,然后采用DPS 9.50软件进行因子分析和聚类分析。对所有蒙顶黄芽样品进行LC-TOF MS分析后,将色谱图数据文件导入《国家药典》委员会发布的中药指纹图谱相似度评价系统(2012.1版),生成四川蒙顶黄芽的LC-TOF/MS共有峰特征指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以标准物质量浓度(mg/mL)为x轴,峰面积为y轴,绘制标准曲线,得到9种水溶性成分对照品溶液的线性回归方程,如表3所示。每种对照品的峰面积与质量浓度间的相关系数均大于0.999,说明线性关系良好。

表3 蒙顶黄芽中多种成分色谱蜂面积 与质量浓度间的线性回归方程Table 3 Linear equation between peak areas and concentrations of Mengding yellow bud components

2.2 四川蒙顶黄芽感官品质研究

四川蒙顶黄芽样品的感官审评结果见表4。由表中可知,24个蒙顶黄芽的感官品质有非常明显的差异,在干茶外形方面,蒙顶黄芽的形状、匀整度等方面差异不大;但在干茶外观颜色方面,1和4号以翠绿为主,8、17和21号以黄为主,其他样品色泽以嫩黄为主。在内质汤色方面,12号嫩黄鲜亮,1、4、14、15、19号和20号的汤色以黄绿为主,2、3、5、6、7、8、11、17号和21号的汤色以黄为主,23号和24号的汤色以淡黄为主,9、10、13、16、18号和22号以绿黄为主。在内质滋味方面,3、6、10、12号和13号以鲜醇为主,2、5、7、8、17、18、19、21号 和22号以醇和为主,9、11、14、15、16、20号和24号以醇厚为主,1号和4以浓厚为主。在内质香气方面,1号和4号以栗香为主,2、5、6、7、12、13、15、16、18、19、20、23号和24号以甜香为主,3、9、10、11、14号和22号以清鲜为主,8、17和21号带火功香。在叶底方面,2、12、14、15、16号和18号以嫩黄为主,3、5、6、7、8、9、10、11、13、19、20、22、23号和24号以黄为主,1号和4号嫩绿较亮,8、17号和21号黄欠亮。综合上述,1号和4号偏绿茶品质特征,8、17和21号偏陈茶品质特征,其他样品呈现黄茶品质特征。24个样品感官审评结果差异很大,主要是由闷黄工序的有无及闷黄条件的不同引起。

表4 不同蒙顶黄芽感官审评结果Table 4 Sensory evaluation results of different Mengding yellow bud

2.3 四川蒙顶黄芽指纹图谱的构建

按照已建立的LC-TOF/MS分析方法,对24个不同厂家的24个蒙顶黄芽样品进行分析,将所得到的色谱图数据文件导入《国家药典》(2012.1版)发布的中药指纹图谱相似度评价系统,得到蒙顶黄芽的LC-TOF/MS指纹图谱,如图1所示。选择出峰时间适中、峰面积在色谱图中所占比例较大,且在四川蒙顶黄芽样品中均稳定存在的3号峰作为参照峰,共发现16个共有峰,如图2所示,通过与对照品液相谱图比对,共确定了9种化合物,分别为GC(没食子儿茶素)、EGC(表没食子儿茶素)、CAF(咖啡碱)、C(儿茶素)、EC(表儿茶素)、EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)、GCG(没食子儿茶素没食子酸酯)、ECG(表儿茶素没食子酸酯)与CG(儿茶素没食子酸酯)。

图1 24个蒙顶黄芽样品的LC-TOF/MS指纹图谱Fig.1 LC-TOF/MS fingerprints of 24 Mengding yellow bud samples

2.4 四川蒙顶黄芽水溶性成分的含量分析

按照1.2.6节中的方法进样10 μL,连续进样3次,计算峰面积平均值,根据相应化合物标准曲线方程,计算各茶叶中8种主要成分的含量,以干质量计,如表5所示。1号、4号的GC、EGC含量较低,EGCG和ECG含量较高,GC和EGC属于非酯性儿茶素,收敛性较弱,味醇和不苦涩;EGCG和ECG酯型儿茶素具有强烈收敛性,苦涩味较重,因此1号和4号呈现出绿茶的滋味特征;8号、17号和21号的EGCG均较低,8号最低,可能是因为在陈放过程中EGCG发生氧化反应而减少,与感官审评结果一致。不同蒙顶黄芽主要水溶性成分含量与周继荣等[9]人的研究结果一致,究其原因是因为苦涩口感特征的EGCG、ECG在闷黄的过程中水解成醇和口感特征的GC、EGC等。

表5 不同蒙顶黄芽主要水溶性成分含量(mg/g)Table 5 Contents of major components in different brands of Mengding yellow bud(mg/g)

图2 蒙顶黄芽水溶性成分共有峰LC-TOF/MS指纹图谱Fig.2 The common peak LC-TOF/MS fingerprint of water-soluble components of Mengding yellow bud注:1:GC;2:EGC;3:CAF;4:EC;5:C; 6:GCG;7:EGCG;8:ECG;9:CG。

从表6可以看出,采用现代工艺闷黄12号的茶多酚含量最低,酚氨比低,可溶性糖和氨基酸含量较高,与感官审评结果一致;1号和4号没经过闷黄,茶多酚和咖啡碱含量高,滋味浓厚;8号、17号和21号茶多酚含量均较低,是因为在贮藏过程中多酚类物质发生氧化反应形成儿茶素类；8号可溶性糖含量较高,可能是在炒黄过程中多糖类物质受高温作用发生脱水反应分解成可溶性糖；11、15、18、17号游离氨基酸总量最低,这可能是氨基酸在贮藏的过程中氧化降解所致[26]。综上所述,不同蒙顶黄芽主要生化成分分析结果与感官审评结果一致。

2.5 四川蒙顶黄芽样品的因子分析和聚类分析

表6 不同蒙顶黄芽主要生化成分分析结果Table 6 Contents of main biochemistry components in different brands of Mengding yellow bud

对蒙顶黄芽样品的品质成分进行因子分析,所得的因子特征值和贡献率如表7所示。根据特征值大于1的原则提取了4个因子,其方差贡献率分别为33.42%、21.23%、16.97%、8.82%,其所包含的信息量占总体信息量的80.44%,基本反映了大部分变量的信息。

表7 因子分析特征值和贡献率Table 7 Eigenvalue and contribution rate of factor analysis

通过对因子的载荷矩阵旋转之后,可使载荷系数更接近1,这样得到的公因子能够更好的解释和命名变量[27-28]。对载荷矩阵进行方差极大正交旋转,得到因子载荷矩阵方差为0.4568,因子载荷矩阵如表8所示。由表8可知,公因子1累积贡献率为28.93%,对应特征向量中贡献最大的是GC、EGC、EC和咖啡碱,其特征向量值均值0.80以上,基本可以代表非酯型儿茶素类和咖啡碱。公因子2累积贡献率为42.48%,对应的特征向量为ECG、CG和可溶性糖,基本可以代表酯型儿茶素类、蛋白质和糖类。公因子3累积贡献率为61.68%,对应的特征向量中贡献最大的C、EGCG和茶多酚,基本可以代表茶多酚。公因子4累积贡献率为75.58%,对应的特征向量为游离氨基酸和酚氨比,基本可代表氨基酸。

表8 因子载荷矩阵Table 8 Rotated component matrix

根据因子分析的结果,对4个公因子(表8)的品质成分采用组间联接的聚类方法和平方欧式距离区间测量法进行聚类分析如图3。在遗传距离小于20处(如图3所示)进行聚类分析,可分为4个大的类群(图3)。没经过闷黄的1、4号聚为一类;采用现代工艺闷黄的12号聚为一类;用陈茶炒黄的8、17号和21号聚为一类;传统工艺闷黄的2、3、5、6、7、9、10、11、13、14、15、16、18、19、20、22、23号和24号聚为一类。不同黄茶样品的聚类分析结果表明,不同加工工艺对黄茶内含化学成分的影响较大,可利用聚类分析对我国不同加工工艺和不同产地的黄茶样品进行初步区分。

图3 不同蒙顶黄芽样品的系统聚类分析结果Fig.3 Results of systematic cluster analysis of different Mengding yellow bud samples

3 结论

目前,对蒙顶黄芽的LC-TOF/MS指纹图谱研究尚未见报道。本试验初步构建了蒙顶黄芽的LC-TOF/MS指纹图谱,结果显示,24个四川蒙顶黄芽样品均有16个共有峰,但峰面积存在差异,说明不同厂家的四川蒙顶黄芽样品,由于生产工艺的差异,造成其内含化学成分含量的不同;通过聚类分析能初步区分不同工艺的蒙顶黄芽样品。闷黄是黄茶品质形成的关键工序,闷黄过程中的湿热作用导致多酚类物质的降低,但黄茶作为轻发酵茶,其品质形成机理可能还有残余酶类参与多酚类化合物的氧化,本身就存在内在的不稳定性,这也是黄茶指纹图谱研究的难点,这就需要实施茶叶的规范化加工,搜集更多全国范围的黄茶,并运用联用技术获得全国黄茶的特征谱及特征性成分,以更好地对黄茶物质基础进行研究。

本实验利用LC-TOF/MS法构建了24个蒙顶黄芽样品的LC-TOF/MS指纹图谱,得到了有关四川蒙顶黄芽质量的综合信息,并在此基础上进行了定量分析,因子分析表明,14个品质成分综合为4个公因子,前4个公因子的特征值大于1且累计贡献率达80.44%,主要代表性指标为儿茶素类、咖啡碱、蛋白质和糖类等,并找到了不同工艺蒙顶黄芽水溶性成分的含量差异;当临界值小于20时,通过聚类分析将24个样品分为4类。LC-TOF/MS指纹图谱结合定量分析分离效率高、分析速度快、准确率高,同时为蒙顶黄芽提供了量化的鉴定方法,比通过单一成分测定得到的结果更为丰富和全面,具有一定的优越性,不仅可应用于黄茶质量评价、黄茶加工工艺全过程的质量控制和最终产品的质量评价,还可以应用于功能性成分的定性和定量,同时可以确保黄茶产品质量的一致性、安全性及可靠性。本研究结果在一定程度上为四川蒙顶黄芽品质真伪的鉴定及产品的进一步开发利用提供了参考依据和数据支持。