桦褐孔菌多糖对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用

刘 畅,崔敬爱,王思霁,于 婷,潘 佳,陈晓平

(吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118)

随着国民经济的飞速发展,居民的生活品质逐步提升,饮食方式和生活方式也发生改变。二十一世纪以来,糖尿病病人的年轻化情况越发严重,糖尿病肾病的发病人数已达到历史最高[1]。大量临床数据显示,糖尿病肾病患者由Ⅰ型糖尿病继发而成的占总数的30%～40%,而由Ⅱ型糖尿病演变而来的也有15%～20%之多,正因如此,糖尿病肾病成为终末期肾脏疾病的第2大病因,位居肾小球肾炎之后[2]。从国际糖尿病联盟官方网站公布的数据来看,截止到2019年,我国共拥有1.164亿糖尿病患者,约占全球糖尿病患者的25%,位居世界首位,据此可以预测,我国糖尿病肾病发病率仍将持续上升[3]。

近年来,大量科研结果发现,高糖、高脂饮食以及生活作息紊乱会加速导致糖尿病病程的产生和发展,而糖尿病已成为糖尿病肾病的首要致病因素[4]。目前,糖尿病肾病的发病机制并未被明确,因此探究预防治疗糖尿病肾病的药物及其机制尤为重要[5]。临床研究证实,桦褐孔菌具有降低血糖、防治肿瘤增生、抗氧化、抵御病毒侵袭等功效[6],大量的国内外专家以及科研学者研究发现,多糖类物质是桦褐孔菌中的发挥主要作用的功能成分[7],它与加强机体抗氧化活性、降低脂质过氧化损伤有密切相关[8],但是有关于桦褐孔菌及其多糖对糖尿病肾病肾脏保护作用及作用机制方面的报道少之又少。

本文以高糖、高脂饲料和STZ(Streptozocin,STZ)联合诱导法构建糖尿病肾病小鼠模型,通过桦褐孔菌多糖(Inonotusobliquuspolysaccharide,IOP)对糖尿病肾病小鼠的基本生长状态、肾功能的影响以及抗氧化指标和肾脏病理的观察等方面研究对桦褐孔菌多糖在糖尿病肾病的防治过程中的作用机制进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

100只SPF级身体健康、体态良好的雄性C57BL/6小鼠,体质量(18～22) g 吉林农业大学实验动物中心提供;野生桦褐孔菌 长春市药材专柜;无水乙醇、氯仿、正丁醇、甲醛、生理盐水 长春大洋化工有限公司;链脲佐菌素 美国Invitrogen公司;碱性蛋白酶沧州夏盛生物技术有限公司;盐酸二甲双胍片 南京亿华药业有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒 索莱宝科技有限公司;尿八联试纸 桂林优利特医疗电子有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

电子天平(H01-B型) 北京和田兴业仪器有限公司;旋转蒸发器(RE-52CS型) 巩义市予泰仪器设备有限公司;UV762型紫外可见分光光度计 上海精科仪器厂;ZL11-01型洁净动物培养箱 吉林农业大学实验动物中心提供;BK-200型全自动生化分析仪 济南欧莱博科学仪器有限公司;强生稳择易血糖仪及配套血糖试纸 强生(中国)公司。

1.2 实验方法

1.2.1 IOP的制备 野生桦褐孔菌经冷冻干燥、打粉粉碎后,过0.425 mm筛,得到桦褐孔菌干粉。称取1 kg野生桦褐孔菌干粉,加4倍蒸馏水,70 ℃水浴30 min,冷却后经纱布过滤,滤渣按料液比1∶2 g/mL加蒸馏水,100 ℃水浴30 min,纱布过滤,混合两次滤液,10000 r/min、25 ℃离心15 min,70 ℃浓缩至800 mL,收集上清液,70 ℃浓缩至200 mL,加无水乙醇,让乙醇在体系中的浓度达到80%,静置24 h,离心取沉淀[9]。利用Sevage法,数次对沉淀脱蛋白,后静置,冷冻干燥即得桦褐孔菌多糖[10]。经多次试验,以葡萄糖为标准品,利用苯酚-硫酸比色法,计算得出:IOP的平均提取率为5.68%,多糖的纯度为81%。

1.2.2 试验动物分组 100 只C57BL/6小鼠普通饲料适应性喂养1周,动物饲养室环境整洁卫生,湿度控制在40%～60%,室内温度控制在22～25 ℃,12 h明暗交替,饲养笼密闭但不密封、安全且无毒。随机抽选10 只为对照组(CK),剩余小鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射STZ溶液,对照组注射同体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,注射3 d后,测定空腹血糖,选择血糖值大于15 mmol/L小鼠纳入正式试验[11]。造模成功的小鼠中选取50 只,随机分为模型组(CK1)、阳性对照组(CK2)、桦褐孔菌多糖低剂量组(Ⅰ)、中剂量组(Ⅱ)、高剂量组(Ⅲ),每组10只,对照组饲喂普通饲料,其余各组高糖高脂饲料喂养,试验期间自由进食、进水,每天上午10点灌胃一次,连续灌胃4周后,颈椎脱臼处死小鼠进行下一步试验。

试验动物分组见表1。本试验获得吉林农业大学实验动物保护协会许可,小鼠按照吉林农业大学实验动物保护和使用规则饲养。

表1 试验动物分组Table 1 Experimental animal grouping

1.2.3 指标检测

1.2.3.1 生长状况监测 每周测1次血糖、称量1次小鼠体重,每天上午观察小鼠一般生长状态,灌胃1次、更换1次垫料。

1.2.3.2 肾功能指标 无菌环境下,将小鼠颈椎脱臼致死,用酒精球擦拭小鼠腹部,迅速用手术剪剪开小鼠腹腔,腹腔主动脉取血0.5 mL,3000 r/min离心5～10 min,分离出血清备用,试验结束后,按照血液分析仪操作规程,测定Scr、BUN和尿蛋白含量[12]。

1.2.3.3 肾脏指数 剪开小鼠腹腔,摘取双肾,用生理盐水冲洗粘连组织,滤纸吸干水分,用镊子将双肾筋膜剥离后称取肾脏质量,试验结束后,计算肾脏指数[13],另一部分肾脏组织保存于10%甲醛溶液中,用于肾脏组织病理学检测。

1.2.3.4 肾脏抗氧化酶活力 剪取肾脏0.15 g,倒入生理盐水1.5 mL,冰浴下充分研磨,匀浆,3000 r/min离心15 min,取上清液备用。试验结束后,严循试剂盒说明书,测定SOD、GSH-Px、CAT活力及MDA的含量。

1.2.3.5 肾脏组织病理学检测 试验结束后,将甲醛溶液固定好的肾脏组织标本取出,经流水冲洗,脱水,透明,浸蜡,包埋,切片后进行HE染色,显微镜40倍物镜下观察肾脏组织病理学改变[14]。

表2 IOP对小鼠体重的影响(g)Table 2 Effect of IOP on body weight of mice(g)

表3 各组小鼠生长情况Table 3 Growth state of mice in each group

1.3 数据分析

采用Excel(2019)对数据进行处理。应用SPSS(20)软件进行统计分析,所有数据以平均数±标准差来表示,组间t检验,组间差异有统计显著性水平用P<0. 05表示,组间差异极显著水平以P<0. 01表示。

2 结果与分析

2.1 IOP对小鼠体重影响

体重是衡量机体健康状况的重要标志之一,它能直观的反应出能量摄入与消耗之间的动态变化。对照组体重由于食用正常饲料,涨幅均为正常小鼠体重变化范围内,而建模后,由于STZ摧毁体内激素水平,加之高糖、高脂饲料喂养,成模小鼠血糖均大幅上升且注射STZ各试验组体重与对照组呈现差异,说明糖尿病模型建造成功[15],结果如表2所示,建模后模型组小鼠体重与对照组相比增加7.0%,差异显著(P<0. 05),试验4周后,模型组小鼠体质量极显著高于对照组，较其高17.6%(P<0.01)。相比较模型组,阳性对照组下降14.9%;各剂量组体重均呈下降趋势,低、中、高剂量组体重分别下降13.4%、14.1%、17.4%。结果表明,桦褐孔菌多糖对糖尿病肾病小鼠体重的抑制效果显著。

2.2 IOP对小鼠的生长情况影响

试验4周后(表3),对小鼠的一般特征进行监测,发现对照组小鼠精神状态较好,毛色黑亮,进食、进水正常,排尿正常,对外界刺激反应灵敏,未发生死亡现象。模型组小鼠普遍状态低迷,进食、进水、排尿均有所增加,对外界刺激反应迟钝。各给药灌胃组的小鼠精神状态逐渐改善,进食水恢复正常,排尿也逐渐趋于正常,桦褐孔菌多糖高剂量组小鼠行动虽不及健康小鼠敏锐,但行动频率和行动状态都极佳。

2.3 IOP对小鼠肾脏的影响

2.3.1 IOP对小鼠肾脏指数的影响 糖尿病肾病模型的建立导致小鼠体内激素分泌紊乱,使小鼠肾脏发生损伤和肿大[16]。灌胃4周后,阳性对照组和桦褐孔菌多糖高剂量的肾脏指数较模型组分别下降了14.9%和15.8%(P<0.01),桦褐孔菌多糖低、中剂量组较模型组肾脏指数分别降低了5.6%和6.2%(P<0.05),结果表明桦褐孔菌多糖对于小鼠肾脏指数的改善效果随多糖浓度增加而增强。

表4 IOP对小鼠肾脏指数的影响Table 4 Effect of IOP on renal index of mice

2.3.2 IOP对小鼠肾脏功能的影响 肌酸在体内代谢分解,其产物就是血肌酐,而蛋白质在体内分解代谢后的末产物即为尿素氮,临床上将血肌酐、尿素氮作为肾衰竭的检测项目,健康人的尿液检查中是并不能检出蛋白质的存在,而一旦在尿常规中检测出小分子蛋白,那么就可以判定该患者肾脏滤过功能不全,本试验对其检测从而判断糖尿病肾病小鼠肾功能情况[16],结果见表5,与对照组相比,模型组的Scr、BUN和尿蛋白含量均极显著升高(P<0.01),这说明糖尿病肾病小鼠的肾功能从不同方面均表现出有损伤情况,经过桦褐孔菌多糖干预4周后,各剂量组的Scr均较模型组相比有下降趋势(P<0.05),且随着浓度增加,下降幅度越大;而在桦褐孔菌多糖干预后,仅高剂量组BUN较模型组有显著下降(P<0.05),其余各剂量组未见明显差异;小鼠在接受桦褐孔菌多糖各剂量组干预后,尿蛋白含量均较模型组降低,且随着浓度增加,尿蛋白含量呈递减趋势(P<0.01)。

表5 IOP对小鼠肾功能的影响Table 5 Effect of IOP on kidney function of mice

表6 IOP对小鼠抗氧化指标的影响Table 6 Effect of IOP on antioxidant indicators in mice

2.4 IOP对小鼠肾脏组织抗氧化能力的影响

高糖、高脂饲料喂食4周后,模型组小鼠肾组织SOD的含量比对照组下降32.3%(P<0.01,表6);模型组小鼠肾组织GSH-Px的含量较对照组下降30.8%(P<0.01);模型组小鼠肾组织CAT含量较对照组水平急剧下降,同比下降了41.8%(P<0.01),但在桦褐孔菌多糖干预4周后,各剂量组小鼠的SOD含量、GSH-Px含量、CAT含量均有所上升,且随着浓度的增加也呈递增趋势,其中高剂量组SOD含量和GSH-Px含量较模型组分别上升了29.8%(P<0.01)和27.9%(P<0.01);CAT含量分别较模型组上升了10.2%、20.8%和23.8%(P<0.05)。高糖、高脂饲料喂食4周后,模型组小鼠肾组织MDA含量较对照组水平升高了50.7%(P<0.01),而桦褐孔菌多糖干预4周后,随着浓度的增加,各剂量组小鼠的MDA含量分别较模型组下降了7.4%、11.4%和14.9%(P<0.05)。

2.5 IOP对小鼠肾脏组织病理学的观察

为了更直观的检验糖尿病肾病小鼠的肾脏有损伤情况,验证桦褐孔菌多糖可以缓解糖尿病肾病小鼠肾脏损伤,我们将小鼠肾脏组织进行HE染色[17],结果如图1所示,对照组小鼠肾小球结构清晰,外形规则饱满,血管充盈,肾间质清晰,细胞核排列均匀且较为圆满;模型组小鼠肾脏结构肾小球结构不清晰,形状不规则且分布不均匀,内部浸润着大量炎性细胞,肾间质模糊,纤维化程度高,细胞核排列杂乱无章,且形状多为椭圆形,细胞核多为空核;各桦褐孔菌多糖剂量组较模型组相比,肾脏结构损伤有所改善,且高剂量组肾小球形状有所缓解较为清晰,肾间质纤维程度稍有缓解,细胞核也逐步恢复。

图1 小鼠肾组织病理图(HE染色)Fig.1 Mice renal hele pathology(HE staining)注:A:CK组;B:CK1组;C:CK2组;D:Ⅰ组;E:Ⅱ组;F:Ⅲ组。

3 讨论与结论

本试验采用STZ诱导与高糖、高脂饲料饮食相结合构建模型的方法,研究了桦褐孔菌多糖对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用。结果表明,在高糖饲养的环境下,小鼠出现肾器官肿胀和肾功能损伤以及肾脏结构损伤症状等症状,经过桦褐孔菌多糖作用后,高剂量组小鼠的体重、肾脏肿大和生活状态不佳有明显的改善效果。可极显著降低糖尿病肾病小鼠的体重和肾脏指数(P<0.01),使小鼠体重下降,肾脏指数降低,小鼠精神状态趋于正常。与模型组相比,高剂量组的桦褐孔菌多糖使小鼠血糖、Scr、BUN和尿蛋白水平下降,肾小球结构混乱和模糊情况有所抑制。表明桦褐孔菌多糖有缓解肾脏结构损伤、修复肾功能损伤的能力。

正常的机体情况下,自身完整的抗氧化酶系统可以保证机体内自由基的动态平衡,而氧化应激状态下,机体内氧化与抗氧化作用则表现为一种相失衡的状态[18],机体内的活性氧簇(ROS)增多或减少,都会造成分子、细胞等不同水平的机体损伤[19]]。但在正常机体反应中,ROS的产生与消减是一种协调平衡,糖尿病患者血糖水平偏高,导致机体内氧自由基增加,但此时机体抗氧化系统削弱,大量的氧自由基存积[20]。SOD是生物体内广泛存在的一种抗氧化金属酶,在机体抗氧化反应中起到重要的作用[21],GSH-Px一般与SOD酶对机体过氧化损伤过程互相促进,起协同作用[22],而在肾脏的氧化还原过程中CAT起着至关重要的作用,它能帮助机体清除大量的自由基,防御细胞膜遭受损伤[23],MDA会引起体内大分子化合物的交联聚合,对细胞产生毒性,可以通过机体内丙二醛的含量可以推断生物膜的过氧化程度,间接反映出机体受自由基的损伤程度。而本实验结果显示,桦褐孔菌多糖能够显著改善糖尿病肾病小鼠的抗氧化能力减弱症状(P<0.01)。模型组小鼠肾组织的抗氧化酶活力系统中SOD、CAT、GSH-Px活力均下降,而在桦褐孔菌多糖各剂量组灌胃4周后,小鼠肾组织的抗氧化酶活力系统中SOD、CAT、GSH-Px活力极显著(P<0.05)上升,MDA含量较模型组显著下降,因此,可以初步判断桦褐孔菌多糖对糖尿病肾病的保护与抗氧化损伤有关。桦褐孔菌多糖高剂量组的效果最为明显,虽与正常水平仍存在一定距离,但总体分析可以看出,桦褐孔菌多糖的确有增强小鼠抵抗脂质过氧化反应的能力,有效抑制机体过氧化和脂质过氧化,从而抑制了糖尿病肾病的进一步进展。

综上所述,桦褐孔菌多糖能够改善小鼠肾脏组织氧化应激反应的进程,保护肾脏组织的损伤和肿大情况,缓解肾脏组织的病理学改变,修复了因炎症造成的肾小球形变和细胞核空核等症状,缓解尿糖尿蛋白现象,从而增强和改善肾功能。此外,本试验发现桦褐孔菌多糖高剂量组对糖尿病肾病有明显的抑制效果,但导致糖尿病肾病的发生还有很多途径,发病机理也各不相同,因此需要进行进一步探究,多方面破解糖尿病肾病这个难题。