核桃低聚肽对大鼠酒精性胃溃疡的预防作用

刘 睿,刘欣然,珠 娜,郝云涛,康家伟,毛瑞雪,侯 超,张 黎,杨 娇,李 勇

(北京大学医学部公共卫生学院,北京 100191)

酒精会引起全身多脏器的损伤,诱发一系列酒源性疾病,其中对胃肠道的损伤最为直接和严重,此外还是肿瘤、神经精神性疾病、糖尿病、高血压、心血管疾病等多种慢性病的危险因素。据统计酒精已造成了全球3.8%的死亡和4.6%的伤残调整寿命年损失,急需引起人们的重视与关注[1]。作为一种常见的致溃疡因子,高浓度的乙醇不仅可以直接腐蚀胃粘膜组织,同时还会引起大量自由基和炎性介质生产与释放,破坏胃黏膜屏障,引起炎症渗出、水肿、糜烂、出血等损伤,引起胃溃疡的产生[2]。酒精性胃溃疡现已成为临床上常见疾病,但现有临床常用治疗药物副作用较多,不宜长期服用。因此,从天然活性物质中寻找安全、有效的胃黏膜保护剂具有重要的社会价值和科研意义。

核桃(JuglansregiaL.)是已知最古老的食物来源之一,与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果。据联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of United Nations,FAO)数据显示,2017年全世界核桃产量达382.96万吨,中国产量192.54万吨,占世界总产量的50.28%,高居首位[3]。核桃具有丰富的营养和药用价值,古时即有“万岁子”、“长寿果”等美誉,被历代医家和养生学家视为益寿精品,国外则称为“二十一世纪超级食品”或“营养坚果”,在国际食品市场上占有重要地位[4-5]。核桃低聚肽(Walnut oligopeptides,WOPs)是利用生物酶解技术从核桃中提取的小分子生物活性肽,主要是由分子量很小但活性很高的短肽分子组成。目前研究已证实WOPs具有提高记忆力[6]、抗辐射[7]、抗疲劳[8]、提高性功能[9]等多种作用。但有关WOPs对酒精性胃溃疡的研究尚无文献报道,值得进一步探索研究。

因此,本研究在既往研究基础上,拟采用无水乙醇诱导的胃溃疡动物模型,探讨WOPs对乙醇诱导的胃溃疡的保护及可其能机制,为WOPs在保健食品及医药领域中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性SD大鼠(体重200±20 g) 70只,购自北京大学医学部实验动物中心,实验动物许可证号:SYXK(京)2016-0041,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0010;核桃低聚肽(WOPs) 外观为淡黄色固体粉末,是通过生物酶解技术从普通核桃中分离得到的小分子生物活性肽类混合物,购自吉林肽谷生物工程有限责任公司。通过高效液相色谱法分析WOPs分子量及氨基酸组成,分子量小于1000的低聚肽占86.5%,小于2000的肽类总量占96.5%;无水乙醇(分析纯) 购自国药集团化学试剂北京有限公司;奥美拉唑肠溶片(批准文号:国药准字H19990114) 北京太洋药业股份有限公司;前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)试剂盒 购自北京麦格泰克科技有限公司。

Adventurer TM通用型分析天平 美国奥豪斯国际贸易有限公司;Eppendorf高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司;电热恒温水浴锅 北京天林恒泰科技有限公司;Nihon Kohden Celltac 2全自动血球计数仪 日本光电工业株式会社;FSH-2A可调高速电动匀浆机 金坛市金南仪器厂;GNP-9080型隔水式恒温培养箱 上海创奕科教设备有限公司;FLUOstar Omega多功能酶标仪 德国 BMG LABTECH公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及干预 适应性喂养1周后,将大鼠随机分为6个剂量组:正常对照组,模型对照组,阳性药物对照组(奥美拉唑,剂量为20 mg/kg·bw),低、中、高WOPs剂量组(220、440、880 mg/kg·bw),每组10只。WOPs剂量设计依据为课题组前期研究发现当WOPs以440 mg/kg·bw剂量给实验动物灌胃干预时,表现出较好的提高学习记忆、抗疲劳和增强免疫力的效果[6,8]。因此,本研究在此基础上,以440 mg/kg·bw为中间剂量,设置了低、中、高三个WOPs剂量组,以进一步探索WOPs的最佳干预剂量。大鼠每日经口灌胃干预,正常对照组和模型对照组给予蒸馏水,阳性药物对照组和WOPs剂量组给予相应浓度受试物,灌胃量为1 mL/100 g。每周称重两次,灌胃干预时间为30 d。

1.2.2 模型制备 连续灌胃30 d后,全部动物禁食24 h(不禁水)。给予大鼠无水乙醇5 mL/kg灌胃,以造成实验性胃溃疡模型,正常对照组给予等量生理盐水灌胃。无水乙醇灌胃1 h后,用乙醚麻醉处死动物,股动脉采血,快速剖腹取出全胃,进行下列指标的检测。

1.2.3 Guth改良法计算胃溃疡指数 乙醚麻醉处死动物后,开腹,取出全胃,沿着胃大弯剪开,冰冻生理盐水洗净胃内容物,观察胃黏膜溃疡发生情况,并用游标卡尺测量出血点或出血带的长度和宽度,釆用Guth改良法[10-11]计算胃溃疡指数,计算标准如表1所示:

1.2.4 全血血常规检测 快速取全血40 μL,加入提前接好4 mL稀释液中,吹打均匀,用全自动血球计数仪测定大鼠血常规。主要检测指标包括:白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、平均红细胞体积、平均血红蛋白量、平均血红蛋白浓度、血小板计数、单核细胞百分比、淋巴细胞百分比。

1.2.5 胃组织PGE2、NO、MPO及炎症因子水平的测定 准确称取胃组织重量,按照重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入9倍体积匀浆介质,剪碎组织,冰水浴制备匀浆,3000 r/min,离心10 min,取上清即10%匀浆上清液贮藏于-20 ℃冰箱中。随后根据试剂盒说明书依次检测匀浆中PGE2、NO、MPO的含量。

表1 胃溃疡指数计算标准Table 1 The scoring criteria of gastric ulcer index

1.3 数据处理

用SPSS 24.0软件对数据进行分析。连续变量数据用均数±标准差表示,行单因素方差分析,采用LSD法进行组间的统计检验;变量转换后仍未达到正态或方差齐的数据,采用Kruskal-Wallis检验进行统计分析。确定P<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 一般情况

在30 d的试验周期内,各试验组大鼠外观体征和行为活动、粪便性状、食量等均未见异常,无中毒体征及死亡。

表2 WOPs对大鼠白细胞和血小板的影响Table 2 Effect of WOPs on white blood cell and platelet of rats

2.2 WOPs对大鼠胃溃疡指数的影响

本研究通过参考人类常见致胃黏膜损伤因素及发病机理,建立了无水乙醇诱导的胃黏膜损伤模型来探讨WOPs对胃黏膜损伤性疾病的可能保护作用。在使用无水乙醇5 mL/kg灌胃后,各组大鼠胃黏膜均呈现不同程度的损伤,损伤发生率达到100%,可判定造模成功。胃损伤指数如图1所示,模型对照组胃溃疡指数最高,与模型对照组相比,WOPs低、中、高剂量组胃溃疡指数明显降低(P<0.05)。阳性药物(奥美拉唑)对照组的干预剂量是根据药物说明书按人推荐服用剂量体重比进行转化的,WOPs高剂量组胃溃疡指数显著低于阳性药物对照组(P<0.05)。以上研究结果表明WOPs在一定程度上可以改善乙醇引起的胃损伤,对无水乙醇诱导的胃溃疡具有较好的保护作用。

图1 WOPs对无水乙醇模型大鼠 胃黏膜损伤积分指数的影响Fig.1 Effect of WOPs on gastric ulcer index in ethanol-treated rats注:*表示各组与正常组相比,差异显著(P<0.05), #表示各组(除正常对照组外)与模型组相比, 差异显著(P<0.05),&表示剂量组与阳性药物 对照组相比,差异显著(P<0.05)。

2.3 WOPs对无水乙醇诱导胃溃疡大鼠血液学指标的影响

血常规是通过血液细胞形态分布及数量变化,及早发现或诊断疾病的一种指标,白细胞、红细胞及血红蛋白等相关指标是血常规检测的核心内容。白细胞包括中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞,在机体受到有害因素刺激及机体出现炎症等情况下,体内白细胞数目会明显增加[12]。当机体在急性感染、受伤或者其他的原因引起血管破损时,血液血小板含量会升高,并释放出促使血管收缩和血液凝固的物质。红细胞是血液中含量最多的血细胞,其数量与形态直接影响体内外气体交换以及正常机体免疫功能。血红蛋白是红细胞的主要组成部分,能与氧结合,运输氧和二氧化碳,在血液气体运输方面扮演着重要的角色。

2.3.1 WOPs对大鼠白细胞和血小板的影响 无水乙醇模型大鼠血常规检测结果结果如表2所示,模型对照组大鼠白细胞计数、单核细胞百分数较正常对照组显著升高(P<0.05)。白细胞计数在WOPs中剂量和高剂量组,单核细胞百分数在阳性药物对照组和WOPs低、中、高剂量组均显著低于模型对照组(P<0.05)。血小板计数水平在奥美拉唑组显著高于其他各组(P<0.05)。淋巴细胞比例在各组间未观察到明显统计学差异(P>0.05)。以上研究结果说明无水乙醇激发了大鼠体内白细胞的大量产生,而WOPs可以有效对抗酒精刺激引起的白细胞水平的升高。

表3 WOPs对大鼠红细胞和血红蛋白的影响Table 3 Effect of WOPs on red blood cell and hemoglobin of rats

表4 WOPs对大鼠胃组织PGE2、MPO和NO活性的影响Table 4 Effect of WOPs on the activities of PGE2,MPO,NO of gastric tissues in rats

2.3.2 WOPs对大鼠红细胞和血红蛋白的影响 如表3所示,阳性药物对照组红细胞计数水平高于正常对照组和模型对照组(P<0.05);与正常对照组相比,其它各组的红细胞平均体积水平显著降低(P<0.05);平均红细胞血红蛋白量水平在阳性药物对照组显著低于正常对照组组和模型对照组(P<0.05),在WOPs高剂量组高于奥美拉唑组(P<0.05);血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度在各组间未观察到明显统计学差异(P>0.05)。阳性药物对照组红细胞计数增加,平均血红蛋白水平下降,这可能与长期服用该药物造成的不良反应有关,而WOPs干预则无此不良反应。

2.4 WOPs对大鼠胃组织PGE2、NO、MPO活性的影响

本研究结果如表3所示,在无水乙醇灌胃造模后,与正常对照组相比,模型对照组PGE2水平显著降低,MPO、NO水平升高(P<0.05),这与Saeed等[21]的研究结果一致。与模型对照组相比,MPO、NO活性在奥美拉唑组和WOPs各组均显著下降,PGE2含量显著增加(P<0.05)。与阳性药物对照组相比,WOPs各组MPO、NO含量均升高,差异具有显著性(P<0.05)。以上研究结果表明WOPs干预可明显改善乙醇摄入导致的胃黏膜PGE2合成的减少,抑制中性粒细胞在胃组织的聚集浸润和iNOS介导的NO的产生,从而发挥防护酒精引起的胃溃疡的作用。

3 结论

WOPs可显著降低大鼠胃溃疡指数,改善血白细胞水平的异常升高,并能通过增加胃组织PGE2水平,降低MPO、NO浓度起到对酒精性胃溃疡的防护作用,表明WOPs对酒精性胃溃疡的发生与发展具有一定的防护作用,具备被开发为新型辅助治疗酒精性胃损伤功能保健品的潜力,这为WOPs应用于胃黏膜损伤性疾病的预防和临床辅助治疗提供了科研依据。但目前对WOPs的研究还处在基础研究阶段,但其胃保护作用的深层机制有待进一步研究和探讨,相应的结果还需要进一步的人群实验与临床研究去证实。