QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中28种农药残留

刘华文,苏海雁,陆小康,薛亚馨,吕 敏,张荣林,莫 迎

(广西-东盟食品检验检测中心,广西南宁 530021)

全球经济发展迅猛,人们生活水平提高,食品安全也越来越得到人们的重视。现今农药在水果蔬菜以及茶叶等农产品上应用十分广泛,导致农药残留量大大增加,如果人们过量摄入残余农药则会产生毒副作用[1]危及身体健康,因此提高农残检测技术以解决食品安全问题日趋重要[2-5]。近年来,国家不断完善食品标准,制定严格的农药残留限量标准[6]。茶叶作为我国传统饮品,深得人们喜爱,具有延缓衰老、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用[7-9]。茶叶需求量和种植面积与日增多,但由于病虫害影响茶叶的产量与质量,人们为防虫使用农药也越来越广,如有触杀毒性的乐果、具有胃毒作用的拟除虫酯类、强杀卵作用的杀螨剂、强渗透作用或腐蚀力的马拉硫磷、杀菌剂多菌灵等,导致茶叶农药残留超出限量范围,从而制约我国茶叶的发展[10-13]。茶叶中含有茶多酚、咖啡碱、色素等多种物质,基质复杂,且茶叶炒制工艺繁琐,水分大量丢失,茶叶农药残留的检测一直备受关注。当前,固相萃取法[14]、固相微萃取法[15]、液-液萃取法[16]、加速溶剂萃取法[17]、基质固相分散法[18]等是检测茶叶中农药残留的常用前处理方法,以上方法局限性在于操作方法繁琐以及试剂消耗量较大。

茶叶成分复杂,农药残留分析时干扰严重。因此,茶叶需要更具针对性的、抗干扰性更强、更准确快速的农药残留检测方法。QuEChERS是美国Anastassiades教授在农产品检测方面提出的一种快速样品前处理技术[19],具有经济环保、操作简便、适用范围广[20-22]等特点。付晓芳等[23]使用QuEChERS法研究了茶叶中氟虫腈残留量的检测方法。本研究利用QuEChERS方法,根据近年国家监督抽检茶叶项目和检出数据,结合GB 2763 - 2019《食品中农药最大残留限量》新增的项目,选取茶叶中28种代表性农药,运用QuEChERS法进行前处理,结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测茶叶中农药的残留,可用于实验室日常检验,同时把该方法用于Fapas能力验证,选取28种农药作为研究对象。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶叶 Fapas能力验证提供的绿茶,分别为空白茶叶和待测茶叶;28种农药标准品 德国Dr. Ehrensterfer DmbH公司;乙腈、丙酮、乙酸、甲酸色谱纯 德国Merck公司;无水硫酸钠、无水硫酸镁、无水醋酸钠、乙酸铵分析纯 国药集团化学试剂有限公司;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基键合硅胶(C18) 天津博纳艾杰尔科技有限公司;实验用水 超纯水。

1290超高效液相色谱仪 美国Agilent公司;API 6500三重四级杆串联质谱仪,配制AB SCIEX数据处理软件、电喷雾源 美国AB SCIEX公司;MS303TS型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)公司;Multi Reax涡旋仪 德国Heidolph;Shaker SA320振荡器 日本YAMATO公司;X3R高速冷冻离心机 美国热电Thermo公司;

1.2 实验方法

样品的前处理:提取:称取粉碎后的茶叶样品2 g(精确至0.01 g)于50 mL聚丙烯具塞离心管中,分别加入10 mL水和15 mL 1%乙酸乙腈,涡旋混匀2 min,再加入QuEChERS盐析剂(1.5 g乙酸钠,6 g无水硫酸镁),立即摇匀,置于振荡器上剧烈振荡3 min(450次/min),置于冰浴中冷却5 min,以10000 r/min离心5 min,上清液待净化。

净化:取上清液1.5 mL置于已预先装有150 mg无水硫酸钠、50 mg C18、50 mg PSA净化材料的15 mL离心管中,涡旋30 s使其充分混匀,再置振荡器上激烈振荡5 min(450次/min)使其净化完全,以10000 r/min离心5 min,滤过(0.22 μm有机滤膜),待检测。

1.3 色谱条件

色谱柱:Capcell PakBB-H C18液相色谱柱(3.0 μm,2.1 mm×150 mm,日本SHISEIDO公司);流动相:A为5 mmol/L乙酸铵(含0.05%甲酸),B为甲醇(含0.05%甲酸)。梯度洗脱程序:0～2.0 min,90% A;2.0～10.0 min,90%～60% A;10.0～20.0 min,60%～5% A;20.0～25.0 min,5% A;25.0～25.1 min,5%～90% A;25.1～30.0 min,90% A;流速:0.30 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:5.0 μL。

1.4 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子扫描模式;检测方式:多反应检测模式;电喷雾电压:5500 V;雾化气(氮气)压力:50.0 psi;辅助气压力:60.0 psi;气帘气(氮气)压力:20.0 psi;碰撞气(氮气)压力:7.0 psi;离子源温度:550 ℃;扫描时间:60 ms;碰撞室入口电压:7 V;碰撞室出口电压:12 V;各目标化合物的质谱采集参数见表1。

1.5 基质匹配工作曲线的配制和绘制

标准储备溶液:分别准确称取适量标准物质,用乙腈或丙酮配制成1000 mg/L的标准储备溶液,-20 ℃保存。分别移取一定体积的各标准储备液于100 mL棕色容量中,用乙腈定容至刻度,得到1 mg/L的混合标准溶液,用于绘制标准曲线。

取空白基质样品,按“1.2”处理后,适量加入上述配制的混合标准工作液,定容至1.0 mL,涡旋混匀,滤过(0.22 μm有机滤膜),上机测定,绘制标准工作曲线。

1.6 数据处理

分别利用Analyst Software和MutiQuant 3.0.2软件(AB SCIEX)进行数据采集及处理,Excel 2013进行数据汇总和分析。

表1 28种农药的质谱采集参数Table 1 MS acquisition parameters of 28 kinds of pesticides

续表

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

分别配制0.1 μg/mL的各化合物标准品,使用电喷雾质谱用蠕动泵持续进样,与适当流速的流动相混合后注入质谱,优化喷雾电压、喷雾器温度等质谱参数,由于大部分化合物结构中含有N、P和卤代烃,易形成[M+H]+、[M+Na]+等加合离子,适用于ESI+扫描模式,且响应强度较好。调整喷针的电压,降低基质等杂质带来的干扰。优化锥孔电压使母离子响应丰度最大且稳定,同时优化碰撞能量,选取响应丰度较高、易得到、出峰稳定的碎片离子作为子离子,再通过配制茶叶基质标准溶液,排除易受基质干扰的碎片,确定定性离子对及定量离子对,具体质谱参数见表1。

2.2 色谱条件优化

在优化的质谱条件下,考察不同色谱柱和不同流动相对目标物质谱信号的影响。本实验对比了3种色谱柱,Waters Atlantis T3色谱柱(3.0 μm,2.1 mm×150 mm),SHISEIDOCapcell Pak BB-H C18色谱柱(3.0 μm,2.1 mm×150 mm),大曹三耀Capcell Core C18色谱柱(2.7 μm,2.1 mm×150 mm)。分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇(0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸铵溶液(0.05% 甲酸)、乙腈(0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸铵溶液(0.05% 甲酸)几种流动相对目标化合物的影响。结果显示使用SHISEIDO BB-H C18色谱柱和甲醇(0.05%甲酸)-水(5 mmol/L乙酸铵0.05%甲酸)体系,适用性更好。甲醇较乙腈在离子响应及分离度上更好,而加入了甲酸可以明显提高28种农药残留的离子化效率,乙酸铵能有效解决峰拖尾和提高信号响应。在梯度洗脱条件下农药出峰均匀,峰形尖锐,分离度好,保留时间适中。28种农药的总离子流图见图1。

图1 28 种农药的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram(TIC)of 28 pesticide residues

2.3 提取条件的优化

在贮藏运输过程中,要保持茶叶含水量低于10%,才能避免茶叶处于活跃状态,产生霉变[24]。目前,在茶叶农残检测中,对提取方法中是否加水存在较多的争议。有研究表明[25],茶叶加水提取的上层清液颜色明显比不加水提取的颜色深,加水提取后大量色素类物质溶出,其基质影响明显高于不加水提取,不利于后续的净化过程,造成提取回收率较差。但在欧盟EN15662-2008[26]中提到使用QuEChERS方法,当样品含水量<80%时,需要提前补水至100%。本实验对比了加水与不加水两种条件对于茶叶中农药提取的影响。同时本实验也比较了乙腈、丙酮、乙酸乙酯及1%乙酸乙腈作为提取溶剂时,对茶叶中农药的提取效果。结果显示,加水后1%乙酸乙腈作为提取溶剂,对各农药均有较好的提取效果,对茶叶基质有较强的渗透作用,加水后哒螨灵、灭多威等农药提取效率明显高于不加水的提取过程,同时加入1%乙酸酸化,避免碱性或中性环境下不稳定的农药的降解和损失。加水浸泡的时间越长,提取的共萃物就越多。LC-MS/MS在m/z 50～2000范围内全扫描得到的总离子图显示,提取液的共萃物更少(图2)。因此,本实验采取加水提取,1%乙酸乙腈作为提取溶剂提取茶叶中的农药。

2.4 净化条件

图2 丙酮(A)、乙酸乙酯(B)、1%乙酸乙腈(C)、乙腈(D)作为提取溶剂的总离子流图Fig.2 TIC of the acetone(A),ethyl acetate(B),1% glacial acetic acid acetonitrile(C)and acetonitrile(D)as solvents for extraction

样品茶叶含有多种色素,经过有机溶剂提取后,样液呈墨绿色,共萃杂质多,直接进仪器分析,既污染分析柱和离子源,又影响仪器的响应。目前净化基质常用的吸附剂有PSA、C18、GCB和MWCNTs。PSA的表面键合极性官能团,具有极性吸附作用和弱阴子交换功能[27],能有效去除样品基质中的有机酸、色素和糖类杂质；GCB具有片状结构,是一种非极性吸附剂,主要用于去除样品中的色素、甾醇和维生素,对含苯环官能团的化合物有较强的吸附作用；C18的有效成分是硅胶键合的十八烷基,具有疏水性,主要是去除脂肪和非极性物质；MWCNTs比表面积大,吸附能力强,能有效的吸附色素和杂质。但是各种净化剂在去除杂质的同时也会吸附目标化合物。研究中加入150 mg无水硫酸镁,旨在去除提取液中的水,保证其他净化填料的吸附效果。由于GCB和MWCNTs能够强烈吸附各种化合物,同时无选择性的对非极性农药也有吸附作用,降低大部分农药的回收率。因此,本实验选取PSA、C18作为净化填料,比较了不同配比PSA、C18的净化效果。取1.5 mL提取液,固定加入10 mg PSA,分别考察C18添加量为10、20、40、50、60、80 mg的回收率,在C18添加量为50 mg时,各农药的回收率最佳;固定C18用量,比较PSA添加量10、20、40、50、60、80 mg的回收率,在PSA添加量为50 mg时,各农药的回收率达到最佳,最终净化配比确定为C1850 mg、PSA 50 mg,在此净化配比下,添加10、50、80 ng/mL浓度水平的28 种目标化合物混合标准溶液的回收率(图3)。

图3 28种农药的回收率Fig.3 Recoveries of 28 pesticides

2.5 基质效应

基质效应(Matrix effect)是指样品中的其他成分对目标分析物离子响应强度的影响,即基质对分析方法准确性的干扰。LC-MS/MS 的基质效应由分析物的共流出组分影响电喷雾离子源的离子化效率所致,也被认为是误差的重要来源,常会导致检测结果偏高或偏低,ESI容易受样品基质的影响,一般使用正离子模式进行检测时,会产生较强的基质抑制效应。基质效应可采用以下公式进行计算:

式中:ME为基质效应;A为溶液标准曲线的斜率;B为基质匹配标准曲线的斜率。

若ME<1,则表现为基质抑制效应,ME>1,则为基质增强效应。本实验对28种化合物的基质效应进行了评估(见图4),发现吡虫啉、稻丰散、啶虫脒、毒死蜱、二唑磷、甲基嘧啶磷、喹螨醚、乐果、绿谷隆、马拉硫磷、嘧霉胺、肟菌脂、乙硫磷、唑虫酰胺、喹硫磷等基质抑制效应不明显;化合物哒螨灵、甲萘威、灭多威、炔螨特、噻嗪酮机制抑制效应较为明显;化合物毒虫畏、呋虫胺、溴氰菊酯存在基质增强效应,而以多菌灵、久效磷、三唑磷、特丁津、沙螟硫磷最为明显。因此,本方法采用配制基质匹配标准工作溶液的方法消除基质影响,能够满足农药残留的检测要求。

图4 28种农药在茶叶中的基质效应Fig.4 Matrix effects of 28 pesticides in tea

2.6 线性范围、检出限与定量限

在优化实验条件下,按“1.5”方法配制6个浓度水平的基质匹配混合标准工作溶液,上机测定,以目标物的质量浓度为横坐标,对应的定量离子峰面积为纵坐标绘制标准曲线。28种目标化合物在各自范围内线性良好,相关系数(r)为0.990～0.998。采用标准添加法进行测定,以定量离子信噪比S/N≥3得到28种目标化合物的检出限(LOD)为0.08～1.26 μg/kg,以S/N≥10得到定量限(LOQ)为0.28～4.20 μg/kg(见表2),满足农药残留的检测要求。

表2 28种待测物的基质效应、检出限、定量限、线性范围、平均回收率和相对标准偏差(n=6)Table 2 Matrix effects,LOD,LOQ,linear ranges,average recoveries and relative standard deviations of 28 analytes(n=6)

2.7 回收率与相对标准偏差

向空白基质样品中添加3个浓度水平(10、50、80 μg/kg)的28种目标化合物混合标准溶液,按“1.2”方法进行前处理后上机测定,每个浓度水平做6个平行试验。计算得到28种待测物的平均回收率均在72.5%～118.5%范围内,相对标准偏差(RSD)为0.8%～16.3%(见表2)。

2.8 本法与国家标准方法的比较

以绿茶为例,参照国家标准方法GB 23200.13 -2016[28]农药的回收率作为理论数值,考察本法的回收率,结果列于表3。结果表明,QuEChERS方法的回收率在72.5%～118.5%之间,国家标准方法的回收率在64.2%～114.8%之间。国家标准方法中嘧霉胺回收率为(0.0%～0.0%),可能加入1 LOQ浓度水平,仪器的灵敏度不高,致使无法检测;炔螨特的回收率为(107.6%～141.7%),可能为基质效应影响。QuEChERS方法的回收率较国家标准方法的回收率有明显提升,同时省略过柱的步骤,减少有机试剂的使用和实验时间。该方法既保证实验结果的准确性和稳定性,又大大提升检验效率。另外,本研究方法还提供哒螨灵、毒虫畏、呋虫胺、久效磷、肟菌脂、溴氰菊酯、唑虫酰胺、嘧霉胺和炔螨特的回收率,为补充标准方法提供数据积累。

表3 QuEChERS方法与国家标准方法 对28种农药回收率的对比Table 3 Comparison of recoveries of 28 pesticides between QuEChERS and the nationl standaeds

续表

表4 QuEChERS方法和国家标准方法 2种农药结果与Fapas结果定值的对比Table 4 Comparison of Fapasassigned value of 2 pesticides between QuEChERS and the nationlstandaeds

2.9 实际样品检测

利用本法和国家标准方法GB 23200.13 -2016对Fapas能力验证的茶叶样品进行测试,样品中检出毒死蜱和杀螟硫磷的结果列于表4,结果满意,说明本法的准确性较高。

3 结论

本文采用QuEChERS方法进行前处理,以超高效液相色谱-串联质谱为检测仪器,建立茶叶中农药残留的筛查检测方法。在最优实验条件下,28种农药在3个添加水平下的回收率为72.5%～118.5%,检出限为0.08～1.26 μg/kg,定量限0.28～4.20 μg/kg,RSD为0.8%～16.3%,满足农药残留的检测要求。与传统样品预处理方法相比,在保证方法的灵敏度、精密度和适用性的基础上,该方法样品前处理成本低,简便快速,灵敏可靠,适合于茶叶中农药残留的定性、定量分析。