超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉和猪肉中利尿剂残留量

薛 颖,花 锦,高 浩,杜利君,徐 瑶,黄立亭,王嘉妮

(1.太原海关技术中心,山西太原 030024; 2.陕西省产品质量监督检验研究院农副食品所,陕西西安 710048)

利尿剂是指一类用于治疗高血压及水肿的药物,如呋塞米、托拉塞米、布美他尼等,能增加钠盐和水分的排出量进而增加尿量[1]。但是利尿剂如果被长期或者过量使用,可能会引起血量下降,甚至低血压、休克、肾衰竭、猝死等副作用[2]。目前,利尿剂会被当成兽药添加到饲料,用于治疗牛乳房炎,或者改善禽蛋蛋白比例等[3]。但一些不法分子会用利尿剂来掩盖其他违禁药物的使用,比如比赛时运动员摄入兴奋剂等违禁药物,通过利尿剂,以达到违禁药物在尿液中浓度降低并尽快排出体外的目的,从而通过药检等。因此,1988年国际奥委会将利尿剂列为禁用物质的兴奋剂类。目前被列在国际奥委会禁用物质表内的利尿剂主要有15种,分为以下四类:髓襻利尿剂、噻嗪类利尿剂及相关化合物、保钾利尿剂、碳酸酐酶抑制剂。呋塞米、螺内酯、布美他尼是山西省于2019年举办第二届全国青年运动会所检测的3种利尿剂。呋塞米、布美他尼属于髓襻利尿剂,螺内酯属于保钾利尿剂,均属于禁用物质。

目前,关于利尿剂的检测方法主要有高效液相色谱法[4-8]、液相色谱串联质谱法[11-24]等。杨旺火[2]采用了高效液相色谱串联质谱法测定饲料中利尿剂的含量。王培龙等[3]采用气相色谱-质谱法作为确证方法确证饲料中利尿剂的含量。唐坤等[6-7]采用了高效液相色谱-荧光法测定人血浆和药品中布美他尼片的含量。谢敏等[8-9]研究了减肥功能食品中非法添加物的检测方法。欧贝丽等[10-13]研究了功能性食品中利尿剂和非法添加物的液相色谱串联质谱检测方法。王旭峰等[14-16]建立了尿液中利尿剂等物质的液相色谱-质谱检测方法。许文佳等[17-23]研究了采用超高效液相色谱串联质谱法检测化妆品中利尿剂等物质的含量。梁杨等[24]建立了人血浆中6种常用利尿剂的液相色谱-质谱法,提出了基于QuEChERS的新方法。

液相色谱法检测灵敏度较低,检测利尿剂时一般是作为初筛,且该方法基质复杂易被干扰;液相色谱串联质谱法虽然前处理较为复杂,但灵敏度高,且可以选择离子,因此具有不易被干扰的特点。因此,液相色谱串联质谱法一般是作为利尿剂检测的确证方法。目前,国内在动物源性食品中检测的文献暂无报道,而且也尚无任何检测的相关标准,不利于执法部门对动物源性食品的监管。本实验采用超高效液相色谱串联质谱对鸡肉和猪肉中呋塞米、螺内酯、布美他尼3种利尿剂药物的检测进行研究,为监管部门对动物源性食品的监测提供执法依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

呋塞米标准品 德国Dr.Ehrensorfer公司,质量分数98.7%;螺内酯标准品 北京曼哈格生物科技有限公司,质量分数99.9%;布美他尼标准品 中国食品药品检定研究院,质量分数99.9%;甲醇、乙酸乙酯、乙腈 色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司;甲酸 色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;C18粉 ODS,50 μm粒径范围,60 Å平均孔径,广州硕谱生物科技有限公司;猪肉、鸡肉 市售。

QTRAP 4500型全自动固相萃取超高效液相色谱质谱联用仪 美国AB SCIEX公司;XP404S型电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集团;EOFO-945616型食品搅拌机 美国TALLBOYS公司;DTA-27型超声波清洗器 湖北鼎泰恒胜科技设备有限公司;Milli-Q型超纯水系统 美国Millipore公司;HC-3518型离心机 科大创新股份有限公司;N-EVAP型氮吹仪 美国ORGANOMATION ASSOCINTES INC公司;GM 200型刀式混合研磨仪 弗尔德(上海)仪器设备有限公司;0.22 μm尼龙滤膜 上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 标准储备溶液:分别称取螺内酯、呋塞米、布美他尼标准品0.010 g于10 mL容量瓶中,用50%甲醇水溶液溶解,超声30 min后定容到10 mL,得到1000 mg/L标准储备溶液。

中间标准溶液:精密量取螺内酯、呋塞米、布美他尼标准储备液1.0 mL,置10 mL容量瓶中,用甲醇配制成10 mg/L中间标准溶液。

标准工作溶液:称取5个鸡肉样品和5个猪肉样品,经1.2.2得到的5个鸡肉空白基质的5个猪肉空白基质。用空白基质分别配制成浓度为1、10、30、250、500 μg/L的鸡肉标准工作溶液和猪肉标准工作溶液,临用现配。

1.2.2 样品处理 本试验参考梁杨[24]对血浆中利尿剂的提取方法和净化方法。在此基础上,本试验还考虑了基质效应,采用基质配标消除基质的影响。

将市售鸡肉和猪肉在-20 ℃的冰箱内密封保存。取适量新鲜或者冷冻解冻的样品,去筋、捣碎均匀。准确称取2 g样品(精确至0.01 g),置于50 mL聚乙烯离心管中,加入10 mL乙酸乙酯溶液,涡旋1 min,超声提取10 min,超声频率为32 kHz,4000 r/min离心10 min,吸取上清液于15 mL离心管中,氮吹吹至近干,加入100 mg C18粉末,用1 mL甲醇∶水(1∶1)溶液溶解,涡旋1 min,过0.22 μm尼龙滤膜,供超高效液相色谱串联质谱联用仪分析测定。

1.2.3 检测条件 液相色谱条件:色谱柱为Hypersil GOLD C18色谱柱(1.9 μm,2.1 mm×50 mm);流动相:A相为0.1%甲酸水溶液,B相为乙腈;流速为0.4 mL/min;柱温40 ℃;进样量为10 μL;梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相比例Table 1 The proportion of mobile phase

质谱条件:离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正负离子同时扫描;监测方式:多反应监测模式(MRM);气帘气(Curtain Gas):30 psi;喷雾气(Gas1):50 psi;辅助雾化气(Gas2):60 psi;离子源温度:600 ℃;电离电压:5500 V/-4500 V;碰撞气:氮气。其它质谱参数见表2。

表2 3种化合物的质谱条件Table 2 MS/MS parameters for three compounds

1.3 数据处理

本试验所得图谱均由数据处理软件MultiQuant 3.0.2处理所得。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

分别用甲醇∶水(1∶1)溶液配制浓度均为0.5 μg·mL-1的螺内酯、呋塞米、布美他尼标准溶液。将这3种利尿剂的标准溶液分别注入ESI离子源,针泵速度设置为10 μL/min。通过对3种利尿剂的进行一级质谱全扫描,发现螺内酯在正离子模式得到的信号高且稳定;呋塞米在正离子模式下,未找到明显的正离子峰,而在负离子模式下得到的信号高且稳定;布美他尼正负离子均可检测到,但在负离子模式下,低丰度离子碎片干扰更少。因此,本试验采用正离子模式扫描螺内酯,负离子模式扫描呋塞米和布美他尼。

呋塞米的分子量为330.74,在高温源内易脱去氢。故条件优化时,理论上将母离子m/z设置为329.7。图1为呋塞米的一级质谱扫描图。如图1所示,母离子的峰强度达到107,根据试验结果,将母离子的m/z确定为328.9。图2为呋塞米碎片离子质谱扫描图。如图2所示,应选择峰强度最高的m/z为284.8和204.9作为呋塞米的特征子离子。与伍丽萍等[12]研究结果一致。

布美他尼的分子量为364.42,它在高温源内易脱去氢,结合试验结果,将母离子m/z设置为363.0。图3是布美他尼的一级质谱扫描图,由图3可见该化合物的母离子强度达到109以上。图4为布美他尼的碎片离子质谱扫描图。由图4可知,应选择峰强度达到105的m/z为319.1和206.9作为布美他尼的特征子离子。与伍丽萍等[12]研究结果一致。

图3 布美他尼一级质谱扫描图Fig.3 The full-scan mass spectrum charts of parentions of Bumetanide

图4 布美他尼碎片离子质谱扫描图Fig.4 The full-scan mass spectrum charts of fragment ions of Bumetanide

杨旺火[2]研究发现,虽然螺内酯的分子量为416.57,但它在高温源内易脱去乙酰基巯基,得到341.2的正离子峰。该峰其信号稳定,可作为螺内酯的一级质谱信号,且二级特征离子信号重现性好,可满足监测要求,因此,本试验条件优化时将m/z为341.2作为母离子。图5为螺内酯的一级质谱描图。如图5所示,m/z为341.2的峰强度达到107以上。图6为螺内酯的碎片离子质谱扫描图。如图6所示,选择二级碎片离子中强度最高的m/z为107.0和187.0,可将其作为螺内酯的特征子离子。与杨旺火[2]对于螺内酯子离子的选择一致。

图5 螺内酯一级质谱扫描图Fig.5 The full-scan mass spectrum charts of parentions of Spironolactone

图6 螺内酯碎片离子质谱扫描图Fig.6 The full-scan mass spectrum charts of fragment ions of Spironolactone

得到3种化合物的子离子后,分别进行去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)的优化。优化后的质谱参数见表2。

2.2 色谱条件的优化

色谱常用的作为流动相的有机试剂是乙腈和甲醇,而水相一般为甲酸水或乙酸铵。因此,考察了不同水相和有机相对目标化合物的影响。本试验用流动相初始比例配制1 μg/L的三种利尿剂混标,在对应流动相条件下在超高效液相色谱串联质谱仪器上进行检测。试验结果见表3。

表3 3种利尿剂在不同流动相条件下的峰面积Table 3 Peak area of three diuretics in different mobile phase

试验表明,用乙腈和0.1%甲酸水溶液作为流动相时,三种化合物的峰面积都是最大。因此,本试验的流动相确定为乙腈和0.1%甲酸水溶液。

2.3 提取溶剂的选择

螺内酯、呋塞米、布美他尼均不溶于水,因此选用提取试剂时选择用有机试剂来进行提取,一般选用的提取试剂有甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯。试验考察了甲醇、乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯溶液对三种利尿剂的回收率影响,试验结果如表4所示。

表4 不同溶剂提取得到的利尿剂的回收率(%)Table 4 Recovery of diuretics extracted by different solvent(%)

由表4可知,乙酸乙酯溶液对化合物提取回收率是最好的,二氯甲烷的是最差的。因此,确定乙酸乙酯为提取溶剂,与梁杨关于血浆中利尿剂的提取效果一致[24]。

2.4 方法的线性范围和检出限

按照2.1、2.2和2.3所优化的条件进行试验,用空白鸡肉基质配制浓度均为1.0 μg/L的标准混合溶液,上机分析,得到3种利尿剂标准溶液的色谱图,见图7～图12。

图7 螺内酯的选择离子流图(341.2/187.0)Fig.7 Selected ion flow charts of Spironolactone(341.2/187.0)

图8 螺内酯的选择离子流图(341.2/107.0)Fig.8 Selected ion flow charts of Spironolactone(341.2/107.0)

图9 呋塞米的选择离子流图(328.9/204.9)Fig.9 Selected ion flow charts of Furosemide(328.9/204.9)

图10 呋塞米的选择离子流图(328.9/284.8)Fig.10 Selected ion flow charts of Furosemide(328.9/284.8)

图7～图12表明,本试验3中利尿剂的标准品的峰形很好,且无干扰,信噪比也均满足(S/N)≥10的要求。

图12 布美他尼的选择离子流图(363.0/319.1)Fig.12 Selected ion flow charts of Bumetanide(363.0/319.1)

本试验考虑到基质效应,选择用鸡肉和猪肉的空白样品稀释中间标准液,配制1.0～500.0 μg/L的系列标准溶液进行测定,以各个化合物的峰面积的平均值为纵坐标y,质量浓度为横坐标x,绘制标准曲线,其相关系数均大于0.996。以信噪比(S/N)≥3为标准,确定方法的检出限(LOD),以信噪比(S/N)≥10为标准,确定方法的定量限(LOQ),结果见表5。

图11 布美他尼的选择离子流图(363.0/206.9)Fig.11 Selected ion flow charts of Bumetanide(363.0/206.9)

表5 3种化合物的线性范围、检出限和定量限Table 5 Linear range,limits of detection and limits of quantification of three compounds

由表5可知,螺内酯、呋塞米、布美他尼标准溶液在浓度1.0～500.0 μg/L范围内线性良好。3种化合物的线性方程及相关系数见表6。

表6 3种化合物的回归方程和相关系数Table 6 Regression equation and correlation coefficient of three compounds

2.5 回收率和精密度

在空白猪肉和鸡肉样品中添加这3种利尿剂定量限的1倍、2倍、10倍,每个浓度进行6个平行,按照1.2进行检测。结果表明3种利尿剂在猪肉中的回收率为67.3%～109.8%之间,RSD在1.7～5.8之间;在鸡肉中的回收率为77.7%～111.6%,RSD在1.2～5.6之间,具体见表7、表8。

表7 猪肉的平均回收率和精密度(n=6)Table 7 Average recoveries and precisions of swine(n=6)

表8 鸡肉的平均回收率和精密度(n=6)Table 8 Average recoveries and precisions of chicken(n=6)

3 结论

本文建立了同时检测鸡肉和猪肉中螺内酯、呋塞米、布美他尼的超高效液相色谱-串联质谱法。通过优化液相和质谱的相关检测参数,使得3种化合物的检出限均达到0.5 μg/kg,定量限均达到1.0 μg/kg。本方法前处理过程较为简单,采用了多反应监测模式(MRM),正负离子可同时采集。本方法灵敏度高,排除了干扰物;重现性好,六次平行的偏差满足相关要求;准确度高,试验的回收率满足《GB/T 27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测》的相关要求。因此,该方法能够对这3种化合物同时进行准确的定性、定量分析。目前,国内尚未有鸡肉和猪肉中利尿剂的检测标准及相关文献。本文的研究扩大了利尿剂的检测范围,为监管部门对鸡肉和猪肉的监管提供了一定的技术支持。但本方法适用范围只有鸡肉和猪肉,还需进一步分析其他动物源性食品中利尿剂的检测方法,为利尿剂检测提供更多的技术支撑。