牛源纤维素降解菌的分离筛选与鉴定

2021-06-16张玉云余祖华李元晓

河南科技大学学报(自然科学版) 2021年5期

张玉云，丁轲，李旺，余祖华，李元晓

(1.河南科技大学宏翔生物饲料实验室，河南洛阳 471023；2.洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，河南洛阳 471023)

0 引言

随着中国养牛业集约化养殖模式的发展，牧场牛粪多以集中处理的方式进行排放，处理不当将导致严重的环境污染。同时，牛粪中有丰富的营养物质，若能合理利用，可作为重要的再生资源[1]。文献[2-3]研究发现：新鲜牛粪含碳27.1%(质量分数，下同)、氮1.57%、磷0.4%、钾0.6%、粗蛋白3.14%、糖7.53%、淀粉4.62%，是发酵有机肥的重要资源。然而，牛粪中的纤维素含量较高且很难被利用，造成了资源浪费。因此，如何高效降解牛粪中纤维素已成为当前养牛业广泛关注的问题[4]。

纤维素的降解需选育高效纤维素降解菌株。目前，学者们研究和应用的纤维素降解菌多以细菌和真菌为主，尤以木霉、曲霉及芽孢杆菌居多[5]。文献[6]研究报道了一株纤维素降解真菌烟曲霉HZ1，其基因组中包含丰富的纤维素酶基因，包括25个内切葡聚糖酶基因、7个外切葡聚糖酶基因和23个β-葡萄糖苷酶基因，表明了其巨大的纤维素降解潜力。文献[7]从土壤中筛选出1株高效纤维素降解菌BacilluspumilusWL-2，其酶活为0.005 3 U/mL，可为开发纤维素降解菌资源提供参考。文献[8]从牛粪中分离出4株有纤维素水解圈的菌XQ-1、XQ-2、XQ-3和XQ-4，经鉴定XQ-1为大肠埃希菌，XQ-2为黏质沙雷菌，XQ-3为雷氏普罗威登斯菌，XQ-4为费格森埃希菌，这些细菌可用于纤维素基质的有效生物降解。本试验从新鲜牛粪样品中分离筛选出一株产纤维素酶活较高的菌株NA10，通过形态特征、生理生化及16S rDNA序列分析进行鉴定，并对其纤维素酶活进行初步测定，为进一步制备复合微生态发酵制剂奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

试验样品为采集于洛阳某养牛场的新鲜牛粪和腐熟牛粪。

1.1.2 主要培养基

富集培养基含羧甲基纤维素钠1 g、磷酸氢二钾0.1 g、氯化钠0.01 g、七水硫酸镁0.03 g、硫酸铵0.15 g、三氯化铁0.000 1 g、磷酸二氢钾0.05 g、蒸馏水100 mL。羧甲基纤维素钠培养基含磷酸氢二钠0.5 g、蛋白胨0.5 g、氯化钠0.5 g、酵母膏0.1 g、七水磷酸二氢钾0.3 g、羧甲基纤维素钠2 g、蒸馏水200 mL。增菌培养基含牛肉膏1.0 g、蛋白胨2.0 g、氯化钠1.0 g、琼脂4 g、蒸馏水200 mL。产酶发酵培养基含羧甲基纤维素钠1 g、硫酸铵0.2 g、蛋白胨0.3 g、酵母膏0.02 g、磷酸二氢钾0.4 g、七水硫酸镁0.03 g、蒸馏水100 mL。

1.1.3 主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒，购于北京艾德莱生物科技有限公司；琼脂糖、GoldView核酸染色剂；6×Loading Buffer、Marker DL 2000、PreMix、50×TAE，均购于生工生物工程(上海)股份有限公司；化学试剂均为分析纯。

1.1.4 主要仪器

超净工作台(苏州净化设备有限公司，型号为SW-CJ-1FD)，电热鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司，型号为DH6-924385-Ⅲ)，紫外分光光度计(上海翱艺仪器有限公司，型号为UV-1200)，高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂，型号为LDZX-50KBS)，恒温水浴锅(上海申安医疗器械厂，型号为XMTD-4000)，恒温摇床(金坛市医疗仪器厂，型号为THZ-82B)，PCR仪(西安天隆科技有限公司，型号为DTC)，电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，型号为JY600C)等。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集培养

取新鲜牛粪和腐熟牛粪各10 g,分别加入装有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，于37 ℃、180 r/min恒温振荡培养箱中，振荡均匀制备成样品混悬液。吸取200 μL样品混悬液,加入装有100 mL富集培养基的锥形瓶中,于37 ℃摇床中培养2～3 d。在超净工作台中，吸取富集液体(10-1)100 μL,加入900 μL的无菌生理盐水中吹打混匀,即得10-2稀释液，依次稀释到10-8。取10-5、10-6、10-7的稀释液100 μL,涂布于羧甲基纤维素钠培养基上，每个梯度涂3个平板，分别于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

1.2.2 菌株的分离与筛选

无菌挑取颜色、形态不一的单菌落在羧甲基纤维素钠培养基上划线培养，重复划线2～3次，直到得到较纯的菌株。挑选单菌落于增菌培养基中37 ℃培养24 h，然后分别吸取2 μL点种到羧甲基纤维素钠平板中，37 ℃培养48 h后，用质量分数为0.5%的碘液浸染1 min，观察菌落周围有无透明圈。将有透明圈的菌株于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2.3 菌株纤维素酶活测定

采用3，5-二硝基水杨酸(dinitrosalicylic,DNS)法测定纤维素酶活(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶,cellulose enzyme activity,CMC)和滤纸酶活(filter paper enzyme activity,FPA)，酶活单位为U/mL(定义为在一定条件下，1 mL粗酶液每分钟水解底物产生1 μg葡萄糖所需酶量)。

葡萄糖曲线的绘制：取6个25 mL具塞刻度试管，分别加入葡萄糖标准溶液(1.0 mg/mL)0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，再分别加入蒸馏水2.0 mL、1.6 mL、1.2 mL、0.8 mL、0.4 mL、0 mL，然后吸取3，5-二硝基水杨酸显色剂1.5 mL分别加入试管中，在沸水浴中煮沸显色10 min，冷却，加纯净水定容至10 mL，摇匀。以1 mL蒸馏水代替葡萄糖作空白管，在540 nm处测吸光度。以吸光值为纵坐标，以葡萄糖质量浓度为横坐标，绘出葡萄糖标准曲线，如图1所示。

酶液的制备：将有透明圈的菌株接种到液体发酵培养基，置于37 ℃、200 r/min的恒温振荡培养箱中培养4 d，然后在离心机中以8 000 r/min离心10 min，收集上清液，留作待测酶液。

测定步骤：参照文献[9]的方法稍作改动。①β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶酶活测定：取25 mL比色管4支(1支作为对照，3支作为样品管)，样品管中加入稀释至100倍的粗酶液0.5 mL，加入3 mL质量分数为1%的CMC-Na溶液；对照管中加入1 mL酶液，沸水浴5 min，冷却加3 mL 1%CMC-Na溶液，与样品管同时放入50 ℃水浴反应30 min后,加入3 mL DNS试剂在沸水浴煮沸10 min，取出立即流水冷却，然后加纯净水定容至10 mL，在540 nm测吸光度。计算公式为：CMC酶活=P×1 000×稀释倍数/0.5×180×30，其中：P为葡萄糖质量浓度,mg/mL；0.5为酶液量,mL；30为糖化时间,min;180为葡萄糖相对分子质量。②滤纸酶活：取25 mL比色管4支(1支作为对照，3支为样品管)，样品管中加入稀释至100倍的粗酶液0.5 mL，再放入50 mg(长6 cm，宽1 cm)的滤纸条，然后加入1 mL、0.1 mol/L、pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液；放有滤纸条的对照管中加入1 mL酶液，沸水浴5 min，冷却，加1 mL、0.1mol/L、pH4.6的醋酸-醋酸钠缓冲液，与样品管同时放入50 ℃水浴反应60 min后,加入3 mL DNS试剂，在沸水浴煮沸10 min，取出后立即流水冷却，然后加纯净水定容至10 mL，在540 nm测吸光度。计算公式：FPA(U/mL)=(葡萄糖质量浓度×酶液定容总体积)/(样品体积×反应时间)。

1.2.4 菌株的形态学鉴定

将菌株在增菌培养基上纯化划线，使其长出单个菌落，观察其形态大小，并挑取少许菌落进行革兰氏染色镜检。

1.2.5 菌株的生理生化鉴定

菌株的生理生化特征依据《伯杰细菌鉴定手册》[10]进行鉴定。

1.2.6 菌株的16S rDNA鉴定

利用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取分离菌株的全基因组，以DNA为模板加入细菌通用引物，上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1429R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)。PCR体系为：PremixTaq12.5 μL，模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，加蒸馏水至25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃再延伸7 min；4 ℃保存。PCR产物用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶检测。将符合要求的PCR产物送至上海生物工程有限公司测序。登录美国国立生物技术中心网站，将所测序列提交到GenBank中进行BLAST分析，选取并下载同源性较高的序列，运用MEGA5.2软件包中的Kimura2-parameter法计算遗传距离，运用Neighbor-Joining法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 产纤维素酶菌株初筛结果

以新鲜牛粪和腐熟牛粪为样品，筛选出了56株菌株，利用点接法将菌株点接在羧甲基纤维素钠培养基上，并结合革兰氏碘液进行染色，初步获得13株具有纤维素降解能力的菌株。测量水解圈直径(H)和菌落直径(C)，并计算水解圈和菌落直径比值(H/C)，结果如表1所示。菌株H/C为1.06～5.35，其中菌株NA10产纤维素酶能力最强。

2.2 菌株NA10的纤维素酶活测定结果

对菌株进行纤维素酶活的测定能进一步确定菌株的纤维素降解能力。采用DNS法对菌株NA10进行纤维素酶活测定，并对其进行纤维素酶活和滤纸酶活测定，试验重复3次，求平均值。试验结果测得NA10的CMC和FPA分别为55.13 U/mL和35.47 U/mL，进一步证明了菌株NA10的纤维素降解能力，并对其进行进一步研究。

2.3 菌株NA10的形态学鉴定结果

将菌株NA10在NA培养基划线培养后，观察菌落形态、质地、边缘及颜色等，并拍照保存，结果如图2所示。由图2a可看出：菌株NA10菌落呈圆形，乳白色不透明，边缘突起，中间轻微凹陷或者圆形实质。挑取少许菌落进行革兰氏染色后在显微镜下观察菌落形态，可看出菌株革兰氏染色为阳性，菌落两头钝圆呈杆状、有中生芽孢，见图2b。

2.4 菌株NA10的生理生化鉴定结果

选取透明圈较大的菌株NA10进行生理生化实验，结果见表2。菌株NA10为革兰氏阳性需氧菌，37 ℃中温菌，能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖和木糖产酸，说明菌株能利用多种糖类物质作为碳源。酶类试验结果表明：菌株NA10能产脲酶、蛋白酶、氧化酶及半乳糖苷酶，且能水解淀粉酶，但明胶液化和过氧化氢酶水解呈阴性；VP实验、吲哚实验、甲基红及硫化氢还原反应均呈阴性；硝酸盐和柠檬酸盐还原为阳性。根据《伯杰细菌鉴定手册》[10]可初步判定菌株NA10为芽孢杆菌属(Bacillus)。

表2 菌株NA10的生化鉴定结果

2.5 菌株NA10的16S rDNA鉴定结果

以菌株NA10的DNA为模板，利用细菌通用引物进行PCR扩增，采用1%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测其PCR产物，并得到了长度为1 500 bp左右的目的条带(见图3)，与预期结果基本一致。将PCR产物送到上海生物工程有限公司测序，测序结果表明菌株NA10的序列长度为1 450 bp。

M.DL2000Mark；1～3.PCR产物3次重复

将测序结果与美国国立生物技术中心网站中已有的16S rDNA序列进行BLAST比对，结果发现菌株NA10与安全芽孢杆菌和短小芽孢杆菌两个株菌的相似度较高，挑选出与该菌株基因相似的菌株14株，通过MEGA7.0软件中的“Neighbor-Joining(NJ)”模块对该序列进行系统进化树分析，结果见图4。由图4可知：菌株NA10与Bacillussafensisstrain MIT1 MT669372.1在进化树上处于同一个分支，同源性高达99.72%，亲缘关系最近，因此，可鉴定该菌株为安全芽孢杆菌(Bacillussafensis)，命名为BacillussafensisNA10。

图4 菌株NA10基于16S rDNA序列系统进化树

3 讨论

本试验以羧甲基纤维素钠为底物来分离纤维素降解菌，再结合0.5%碘液染色,根据纤维素酶解圈进一步排除一些不能利用羧甲基纤维素钠的菌株，这种方法排除了不必要的杂菌。进一步进行纤维素酶活测定，筛选出一株纤维素酶活较高的菌株NA10，通过形态学、生化试验及16S rDNA基因序列鉴定，该菌株为芽孢杆菌属的安全芽孢杆菌(Bacillussafensis)，3种鉴定结果相结合，准确可靠。文献[11-15]研究发现:安全芽孢杆菌在试验中不仅能发酵各种糖产酸，而且在产酶方面比较强，且耐盐，很早以前就有研究报道从土壤、海水、动物排泄物及昆虫肠道中分离出了具有不同功能的安全芽孢杆菌，比如有的在Oxidase反应中呈阳性，能产氧化氢酶、碱性磷酸酶、β葡糖苷酶、酯酶、胰蛋白酶、色氨酸脱氨酶、几丁质酶和脂肪酶等多种酶，也有的对酪蛋白、淀粉水解呈阴性，但柠檬酸盐利用呈阳性，且能广泛利用多种糖类、酯类等物质。本试验筛选的安全芽孢杆菌NA10不仅能水解酪蛋白及淀粉酶，还能产除了过氧化氢酶以外的多种酶，以纤维素为底物发现还能产纤维素酶，与文献研究对比存在差异，可能是与培养条件及环境影响有关，或者因其与短小芽孢杆菌高度相似的特异性基因型有关。此外,文献[16]研究发现:安全芽孢杆菌MS11对砷、硼、镉、铬、铜、镍、铅和锌等重金属具有较高的抗性。文献[17]报道了另外414种从碳氢化合物和重金属污染场地分离出的耐重金属安全芽孢杆菌BBN7，该菌株对阿莫西林、青霉素、头孢菌素、头孢他啶、头孢噻肟和氨香豆素等抗生素表现出耐药性，不仅可促进植物生长、抑制病虫害，还能进行生物修复，其功能应用广泛，已得到证实。由此可见，安全芽孢杆菌作为益生菌在生物技术应用方面较为广泛，不仅能应用到农业方面，在发酵有机肥方面也有很大潜力。

根据文献[18-20]研究发现:测定纤维素酶活的方法有很多，但其测定结果受到测定酶活的反应条件如反应温度、pH、发酵时间和酶液浓度等因素的影响，另外，碳源、氮源及反应底物等也是产纤维素酶活的主要影响因素。NA10的CMC和FPA分别为55.13 U/mL和35.47 U/mL，此酶活结果高于文献[21]报道的蜡状芽孢杆菌(4.12 U/mL)及文献[22]报道的地衣芽孢杆菌(0.10 U/mL)的酶活，但低于文献[23]报道的枯草芽孢杆菌(358.28 U/mL)的酶活，可能是因为安全芽孢杆菌的多种产酶特性导致其单一酶活不高，或者菌株在后期生长衰退，菌体细胞进行了自溶或者进入凋亡期，还可能受到了环境条件、培养基成分及产酶发酵时间等因素的影响，导致酶的分泌减少。此次分离的有效菌株中NA10的酶活最高，这在以往的研究中还没有报道，后期将会对该菌株的酶学特性进行研究，对其产酶条件进一步优化，使其在最佳发酵条件下发挥潜能。此外，还需要研究该菌株应用到动物粪便中的纤维素降解效率，及其在堆肥过程中的除臭效果，为动物粪便中纤维素降解菌的合理利用提供科学依据。