不同抗生素对卷叶贝母鳞片叶诱导生长的影响

马涛 陈芳 王跃华 李含霜 王帅 王铭愉

摘要 [目的]研究不同种类和浓度的抗生素对卷叶贝母鳞片叶诱导生长的影响。[方法]分别将不同浓度的头孢霉素、头孢曲松钠和头孢噻肟钠抗生素添加到卷叶贝母鳞片叶的生长培养基中进行诱导培养，研究不同种类和浓度的抗生素对卷叶贝母鳞片叶生长的影响。[结果]不同浓度的3种抗生素对卷叶贝母鳞片叶诱导生长作用的影响是不同的。与对照试验比较，在培养基中添加不同浓度的头孢霉素对其愈伤组织的诱导均有抑制作用，以添加浓度为800 mg/L的头孢霉素对其愈伤组织的抑制作用最强，其愈伤组织的诱导率最低，仅为25.18%，但当其添加浓度为200 mg/L时，芽的诱导率最高，为47.50%;在培养基中添加头孢曲松钠的浓度为200 mg/L时，其卷叶贝母鳞片叶的愈伤组织诱导率和芽诱导率均最高，分别为100%和82.52%;在培养基中添加400 mg/L的头孢噻肟钠时，诱导愈伤组织的效果最好，诱导率为100%;而在添加浓度为200 mg/L时，其芽诱导率最高，为92.53%。[结论]该研究为下一步开展卷叶贝母植物遗传转化工作提供理论依据。

关键词 卷叶贝母;鳞片叶;抗生素;诱导;生长;影响

中图分类号 S567.23+1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）10-0161-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.043

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Different Antibiotics on the Growth of Scaly Leaf of Fritillaria cirrhosa

MA Tao，CHEN Fang，WANG Yue-hua et al

（School of Pharmacy and Bioengineering，Chengdu University，Chengdu，Sichuan 610106）

Abstract [Objective]To study the effects of antibiotics under different kinds and concentrations on the induced growth of Fritillaria cirrhosa scaly leaf.[Method]Different concentrations of cephalosporin， ceftriaxone sodium and cefotaxime sodium antibiotics were added to the growth medium of Fritillaria cirrhosa scaly leaves for induction culture， to study the effects of different kinds and concentrations of antibiotics on the growth of Fritillaria cirrhosa's scales.[Result]Different concentrations of 3 antibiotics had different effects on the growth induction of Fritillaria cirrhosa scaly leaf. Compared with the control experiment， adding different concentration of cephalosporins in culture toxin on the callus induction has inhibitory effect， to add a concentration of 800 mg/L of cephalosporins drug the strongest inhibitory effect of the callus， the callus induction rate lowest was only 25.18%， but when added concentration of 200 mg/L， bud induction rate was as high as 47.50%;when ceftriaxone sodium was added to the medium at a concentration of 200 mg/L， the callus induction rate and bud induction rate of Fritillaria cirrhosa scales were at the highest of 100% and 82.52% respectively;when 400 mg/L cefotaxime sodium was added to the medium， the callus induction effect was the best， with the induction rate of 100%;when the concentration was 200 mg/L， the highest bud induction rate was 92.53%.[Conclusion]This research provides a theoretical basis for the next step of genetic transformation of Fritillaria cirrhosa.

Key words Fritillaria cirrhosa;Scaly leaf;Antibiotics;Induction;Growth;Effect

卷葉贝母是百合科植物，其鳞茎是名贵中药材，具有疗效卓著的润肺止咳作用。近年来，因其价格上涨，加之无计划地盲目采挖，致使其自然资源日趋枯竭。而采用生物工程的遗传转化技术，可有效地改变药用植物的基因型及性状，培育出优良的卷叶贝母植物新品种。当前在药用植物的遗传转化过程中，常采用操作方法简单、转化效率高和获得拷贝数少的农杆菌介导转化方法[1]。而在采用农杆菌介导法遗传转化植物的过程中，选择出特定种类和浓度的抗生素来有效抑制其菌类的生长是非常必要的[2]。

实现药用植物遗传转化的成功，在考虑选择出能有效抑制农杆菌生长的抗生素种类和浓度的同时，还要考虑到选择出的抗生素种类和浓度对已转化的植物生长不能造成危害。研究表明，向培养基中加入不适宜的抗生素种类和浓度会对成功转化植物的正常生长和分化造成严重的影响[3-6]。因此，笔者主要研究头孢霉素、头孢噻肟钠和头孢曲松钠3种抗生素在不同浓度条件下对卷叶贝母鳞片叶诱导和生长情况的影响，以期为下一步开展卷叶贝母植物遗传转化工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

卷叶贝母植物的鳞茎，来自川贝母野生抚育基地（位于康定折多山），由成都恩威集团提供。

细胞分裂素（6-BA）、生长素（NAA），成都市科隆化学品有限公司;头孢霉素、頭孢噻肟钠和头孢曲松钠抗生素药品由哈药集团生产。

1.2 外植体的处理

将卷叶贝母鳞茎从抚育基地采回后，清洗干净，挑选质量优良（无病、无损伤）的鳞片叶，再用碱性洗液清洗，要求在流水中清洗2 h左右。然后将鳞片叶表面的水擦干，进入超净工作室，用升汞处理卷叶贝母鳞片叶（浓度0.1%，消毒时间8～10 min）。再用无菌水清洗3～5次，切成0.5 cm2大小，备用。

1.3 不同抗生素对卷叶贝母鳞片叶诱导生长的影响

将鳞片叶切成0.5 cm×0.5 cm大小，分别接种到添加了浓度为200、400、600和800 mg/L的头孢霉素、头孢曲松钠、头孢噻肟钠的MS培养基中，并以不加入抗生素为对照。培养条件为光照强度1 500 lx，培养温度20 ℃[7]，经30 d培养后统计鳞片叶的愈伤组织诱导率、芽诱导率和鳞片叶外植体褐化率。

愈伤组织诱导率=（产生愈伤组织的鳞片叶数/接种鳞片叶总数）×100%

芽诱导率=（产生芽的鳞片叶数/接种鳞片叶总数）×100%

鳞片叶外植体褐化率=（褐化鳞片叶外植体数/接种鳞片叶外植体数）×100%

2 结果与分析

2.1 不同抗生素对卷叶贝母诱导率的影响

由图1可知，头孢霉素抗生素对卷叶贝母鳞片叶的愈伤组织产生抑制作用，并且随着头孢霉素抗生素浓度逐渐增高，其抑制作用更加明显;当培养基中添加的头孢霉素浓度为800 mg/L时，其愈伤组织诱导率仅为25.18%，明显低于对照组的97.51%。通过观察还发现，在此条件下产生的愈伤组织质地疏松、颜色多为白色，很难在后续的继代中快速生长。

头孢曲松钠和头孢噻肟钠2种抗生素在卷叶贝母鳞片叶培养生长过程中，都表现出低浓度促进生长和高浓度抑制生长的状况，但2种抗生素对卷叶贝母鳞片叶生长的具体影响是不完全相同的。

在培养基中添加头孢曲松钠浓度为200 mg/L 时，在培养30 d后统计，其鳞片叶的愈伤组织诱导率为最高，达100%，相对于对照组增长了2.55%;但随着头孢曲松钠浓度再进一步升高，其抑制作用逐渐显现，当培养基中添加头孢曲松钠浓度为800 mg/L时，对其鳞片叶产生愈伤组织的抑制作用最强，即愈伤组织的诱导率最低，仅为40.47%。

在培养基中添加浓度为200和400 mg/L的头孢噻肟钠时，培养30 d后统计鳞片叶的愈伤组织诱导率均高于对照组，分别为98.79%和100%，由此说明浓度为200和400 mg/L的头孢噻肟钠都可促进卷叶贝母鳞片叶产生愈伤组织，并且以浓度为400 mg/L的头孢噻肟钠促进鳞片叶诱导愈伤组织的作用最强;另外，通过观察发现在此条件下产生的愈伤组织呈淡黄绿色、质地紧密，并在后续的继代培养过程中增速度也快。但随着头孢噻肟钠浓度进一步提高，逐渐显现抑制作用，当培养基中添加头孢噻肟钠浓度为800 mg/L时，对卷叶贝母鳞片叶愈伤组织生长的抑制作用最强，愈伤组织的诱导率最低，为47.45%。

2.2 不同抗生素对卷叶贝母芽诱导率的影响

根据图2的芽诱导率试验数据分析可知，在培养基中添加浓度为200 mg/L 的头孢霉素、头孢曲松钠和头孢噻肟钠3种抗生素均有利于卷叶贝母鳞片叶产生不定芽，在培养30 d后统计其芽诱导率分别为47.50%、82.52%和92.53%，都高于对照组（30.38%）;其中以200 mg/L的头孢噻肟钠抗生素促进作用最强，其次为头孢曲松钠，而头孢霉素对卷叶贝母鳞片叶诱导产生不定芽的促进作用相对最弱。但当3种抗生素在培养基中的添加浓度达到和超过400 mg/L以上时，对其鳞片叶诱导产生不定芽的促进作用逐渐减弱，当培养基中添加的头孢霉素、头孢曲松钠和头孢噻肟钠3种抗生素的浓度为800 mg/L时，其对不定芽的诱导作用均表现为抑制，其中以头孢霉素抗生素的抑制作用表现为最强，在培养30 d后统计其芽诱导率仅为5.27%，相对于对照组下降了82.65%。而3种抗生素对卷叶贝母鳞片叶愈伤组织的芽诱导率均表现为低浓度促进生长和高浓度抑制生长。

2.3 不同抗生素对卷叶贝母褐化率的影响

从图3试验结果中鳞片叶外植体受到的褐化情况来看，3种抗生素对鳞片叶外植体的褐化都起促进作用，即在培养基中添加抗生素都会使外植体产生褐化。在培养基中添加浓度为200 mg/L 的3种抗生素对鳞片叶外植体均不产生明显的褐化;但随着在培养基中添加抗生素浓度的逐渐升高，3种抗生素也均会促使外植体的褐化产生。3种抗生素对卷叶贝母外植体褐化的具体影响是不完全相同的。其中头孢曲松钠和头孢噻肟钠在浓度为200 mg/L时，褐化率为0，当超过200 mg/L 时，头孢曲松钠对卷叶贝母外植体褐化的影响十分明显，呈现直线上升状态。而头孢噻肟钠对卷叶贝母外植体褐化的影响有一个缓冲，但当头孢曲松钠和头孢噻肟钠的添加浓度为800 mg/L 时，二者对其褐化的影响达到最高，即褐化率最高，分别为57.51%和47.51%，严重影响卷叶贝母鳞片叶诱导生长。

观察分析试验发现，在培养基中添加的头孢霉素、头孢曲松钠和头孢噻肟钠3种抗生素中，以头孢霉素对卷叶贝母鳞片叶的褐化程度影响为最小，在培养基中添加浓度小于600 mg/L时，不会造成鳞片叶外植体的褐化产生，但当其浓度升高达到600 mg/L以上时，鳞片叶外植体也出现了褐化，褐化率为10.72%，当添加浓度最高为800 mg/L时，头孢霉素对卷叶贝母外植体褐化的影响也仅有15.32%。

3 讨论与结论

在农杆菌介导转化中，将外植体与农杆菌共培养后，必须要选择出适宜的抗生素来进行有效除菌，以防止大量生长的农杆菌对转化植物产生的危害。抗生素不仅在植物遗传转化过程中具有很好的除菌作用，能有效确保成功转化的植物材料存活，而且有的抗生素会直接影响植物组织的生长和分化，表现出类似植物激素的效应[8]。为探究这种影响进行抗生素种类和浓度的筛选是很必要的。该研究采用卷叶贝母的鳞片叶作为外植体，研究不同浓度的头孢霉素、头孢曲松钠、头孢噻肟钠对卷叶贝母愈伤组织诱导和生长的影响。

该试验结果表明，不同质量浓度的头孢霉素对卷叶贝母鳞片叶愈伤组织诱导和生长有一定的抑制作用。随着头孢霉素质量浓度的提高，头孢霉素对愈伤组织的抑制作用加重，这与杨凤美等[9]研究葡萄风信子愈伤组织和高行英等[10]研究韭菜根愈伤组织得到的结果一致。而头孢霉素质量浓度低于200 mg/L对芽诱导影响不大，但是随着浓度增加，逐渐开始对分化产生较大抑制作用。从褐化情况看，低于200 mg/L的头孢霉素对愈伤组织几乎无影响，随着浓度加大有轻微褐化现象。根据头孢霉素对愈伤组织诱导生长和分化再生能力的影响，综合考虑，初步确定用头孢霉素进行处理时，当头孢霉素的浓度为200 mg/L时是比较好的培养浓度，即卷叶贝母愈伤组织的敏感浓度为200 mg/L。

植物离体培养时，培养基中植物激素添加的比例会影响愈伤组织的形成和分化出苗[11]。相对于头孢霉素，头孢噻肟钠、头孢曲松钠对卷叶贝母愈伤组织毒性较小，并且在较低浓度时对愈伤组织都表现出植物生长激素类似效应。在头孢噻肟钠质量浓度低于400 mg/L时，对愈伤组织诱导都有促进作用;而头孢曲松钠在低于200 mg/L对愈伤组织也有促进作用，其原因是抗生素与生长素2，4-D和NAA等的化学结构有相似之处，因而在组织培养中也具有与激素类似的效应，适当浓度的该类抗生素能促进愈伤组织的分化与生长[12]。而从芽诱导率看，与胡雨逸[13]在研究木瓜不定芽再生时得到类似规律，随着头孢曲松钠浓度逐渐增加，愈伤组织诱导率和丛生芽平均增殖率呈现先上升后下降的趋势，200 mg/L处最高，达100%;低于400 mg/L的头孢噻肟钠诱导率也明显高于对照组，表现出对芽分化具有强促进作用，这与茹磊等[14]研究头孢噻肟钠对大白菜不定芽分化的影响结果一致。头孢曲松钠和头孢噻肟钠都表现出对芽分化有强烈促进作用，有类似于细胞分裂素的作用，其机理有待进一步研究;而从褐化情况看，这2种抗生素在高浓度时，愈伤组织会出现褐化现象，证明抗生素对愈伤组织产生毒害作用，迫使愈伤组织褐化直至死亡。综合试验结果，初步認为200 mg/L是愈伤组织对头孢曲松钠的敏感质量浓度，而400 mg/L则为头孢噻肟钠的敏感质量浓度。

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