大丽轮枝菌致病机理及相关致病基因研究进展

金利容 黄薇 杨妮娜 尹海辰 万鹏

摘要 大丽轮枝菌是农作物上为害最严重的土传病原物之一，对于该病原物引起的病害目前仍缺乏有效的防控手段，而明确其致病机理被认为是开发新型药剂和防治技术的理论基础。综述了大丽轮枝菌的侵染过程、植物细胞壁的降解、微菌核和黑色素的形成等一些重要的生理过程相关的致病基因，并总结了转录调控基因、毒力蛋白基因、效应因子、无毒基因和激发子等多方面致病相关基因的研究结果，最后概述了筛选致病基因和研究基因功能的方法。

关键词 大丽轮枝菌;致病机理;致病基因

中图分类号 S435.621.2  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）10-0015-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.005

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research Progress on the Pathogenesis and Pathogenic Related Genes of Verticillium dahliae

JIN Li-rong， HUANG Wei， YANG Ni-na et al

（Key Laboratory of  Integrated Management of Crop Pests in Central China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Plant Protection， Soil and Fertilizer， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei  430064）

Abstract Verticillium dahliae was one of the most destructive soil-borne pathogens in crop plants. There was no effective method to control the diseases caused by V. dahliae. The studies on its pathogenic mechanism were thought as the theoretical basis to develop new pesticides and  control techniques. This article reviewed some pathogenic genes related with some important physiological processes such as the process of infection， the degradation of plant cell walls and the formation of microsclerotia and melanin. The research results of multiple pathogenic genes such as transcriptional regulatory genes， virulence protein genes， effector genes， avirulence genes and elicitors were summarized. The strategies of screening the pathogenic genes and researching the functions of the genes were summarized.

Key words Verticillium dahliae;Pathogenesis;Pathogenic genes

大麗轮枝菌（Verticillium dahliae）隶属半知菌类丝孢纲丝孢目丛梗孢科轮枝菌属。大丽轮枝菌是一种通过土壤传播的植物病原真菌，病原菌能够定殖在植物维管束内，引起植物的萎蔫症状。大丽轮枝菌在世界范围内均有分布，且寄主范围广泛，可侵染660多种植物，包括经济作物（如棉花、茄子、番茄、西瓜等）及粮食作物（如马铃薯等），对农作物的生产可造成严重的经济损失。大丽轮枝菌侵染寄主后会引起萎蔫症状，俗称黄萎病。大丽轮枝菌引起的病害较难控制的一个重要原因在于其能够形成微菌核的休眠结构，微菌核可以在土壤中长期存活，且其抵御外界逆境的能力强。因此，科学家试图通过研究病原菌致病的分子机制和信号通路，寻找病害防治的新策略。随着研究的不断深入，近几年大量文献报道了大丽轮枝菌致病的相关基因，试图阐述其致病的分子机理。随着高通量测序技术的发展，2008年美国Broad研究所完成了从莴苣中分离出来的大丽轮枝菌VdLs.17菌株的全基因组测序工作，整个基因组大小为33.8 Mb，编码10 535个蛋白。测序工作为致病相关基因的研究提供了更好的平台。

笔者对国内外关于大丽轮枝菌的致病机理及相关致病基因的研究进行了综述，以期为更好地防治此类病害提供理论依据。

1 大丽轮枝菌的致病基因

1.1 大丽轮枝菌侵染过程相关的致病基因

研究者们利用荧光蛋白标记技术对大丽轮枝菌菌株进行标记，并观察和记

录大丽轮枝菌对寄主植物的侵染过程。以棉花和拟南芥为研究对象，当大丽轮枝菌接种到寄主植物的根部，2～ 6 h后分生孢子吸附在根的表面，并随机分布在寄主的主根或侧根;12 h后，部分分生孢子萌发，形成芽管和菌丝;2 d后，大量菌丝包裹在根部表面并进入根部组织，在根部组织内纵向和横向扩展;5 d后，菌丝在纵向延伸时快速增殖，同时菌丝向维管组织中扩展，并在木质部中形成一个菌丝网[1]。10 d后，菌丝沿木质部导管向上延伸到地上组织，并到达侧枝部分;12 d后，菌丝向根尖区域延伸，导致根冠塌陷;14 d后，根部菌丝减少，地上部分开始出现萎蔫症状[2]。

整个侵染过程涉及复杂的分子调控机制。在侵染的初始阶段，与稻瘟病菌一样，大丽轮枝菌也会形成附着枝和侵染钉。其中，2个基因VdNoxB和VdPls1被证实在侵染钉的形成过程发挥重要作用，VdNoxB编码一个膜结合型NADPH氧化酶的催化亚基，VdPls1编码一个四跨膜蛋白，它们形成复合物，共同定位于附着枝基部。复合物VdNoxB/VdPls1通过介导活性氧的产生来提高细胞内的钙离子含量，进而激活转录因子Crz1介导的信号途径，最终促进侵染钉的形成[3]。当2个基因分别缺失时，侵染钉便不能形成，导致菌株的致病力下降。侵染钉衍生形成的菌丝颈将附着枝和侵染菌丝分离开，形成一个病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白（如毒力蛋白、效应蛋白）以及一些信号分子通过囊泡运输和胞吐作用被输送到这个侵染界面，形成蛋白环。大丽轮枝菌的VdSep5基因、囊泡转运因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亚基VdExo70参与分泌蛋白向侵染界面的传送过程，这些基因的缺失均能够阻碍分泌蛋白向侵染界面的传输，导致菌株毒力的下降。在菌株对根部的感染过程中，菌丝颈是一个重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通过抑制和逃避寄主植物的防御反应，实现对寄主的成功感染[4]。

1.2 细胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后会分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如细胞壁降解酶（CWDE），细胞壁降解酶通过降解寄主的细胞壁突破寄主表面的物理屏障，为侵染做准备。CWDE可分为果胶酶、角质酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、内葡聚糖酶、蛋白酶等，与其他真菌相比，大丽轮枝菌编码更多数量和种类的碳水化合物降解酶基因[5]，这能够解释大丽轮枝菌在接种后能够在较短时间内扫除植物体内一些果胶物质的障碍，进而完成在木质部导管内的定殖和扩散，同时不同的水解酶能够降解不同寄主植物的细胞壁组织，也是大丽轮枝菌具有广泛寄主的原因之一。大丽轮枝菌编码最多的水解酶类是多糖裂解酶，可以水解不同种类的果胶，这些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果胶酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大丽轮枝菌中含有丰富的果胶酶，果胶酶可以水解寄主植物所产生的果胶，其降解产物还可以作为重要的营养物质为病原菌的生长发育提供能量[6]。利用生物信息学预测到大丽轮枝菌分泌组中存在大量的果胶酶[7]，包括14个PL1家族的果胶裂解酶和10个GH28家族的果胶水解酶，大丽轮枝菌分泌的果胶酶与其致病力相关，强致病力菌株分泌的果胶酶较多，而弱致病力菌株分泌的果胶酶则较少甚至不分泌。同时，不同果胶酶对病原菌致病力的影响存在较大差异，有些果胶酶基因的缺失能够引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失对致病力并没有影响。果胶酶基因VdPEL1[8]和角质酶基因VdCUT11[9]都能够诱导细胞死亡和植物的防御反应，2个基因的缺失均能够导致菌株Vd991在棉花寄主上的毒力显著降低。内切葡聚糖酶能够降解植物的纤维素，内切葡聚糖酶基因VdEg-1对于早期的侵染定殖至关重要，该基因的缺失导致病原菌在莴苣上不能很好地定殖[10]。特异分泌蛋白VdSSP1是一种重要的细胞壁降解酶，研究证实VdSSP1的缺失能够降低其对果胶和淀粉的利用率以及对棉花的致病力[11]。蔗糖非发酵蛋白激酶VdSNF1（sucrose non-fermenting protein kinase 1，SNF1）是细胞壁水解酶上游的一个负调控基因，主要参与糖类信号和真菌发育信号的传递。该基因的缺失导致病原菌对果胶和半乳糖的利用能力受到严重影响，且可以引起番茄寄主的致病力下降达到87%，在寄主植物维管束内不能成功定殖[12]。几丁质酶基因（VdECH）编码的蛋白能够引起植物的超敏反应和防御反应以及一些信号转导和抗性相关基因的表达上调[13]。

细胞壁降解酶大部分是多基因家族或没有同源关系的基因编码的多肽，除了包含一些关键基因，也包含一些功能重复的基因，多个基因之间相互调控，共同参与了真菌生物学毒性的产生过程，因此在缺失功能上冗余的其中一个基因后并不会产生致病力的变化，但一些关键基因的缺失还是会导致毒力的显著下降或丧失。总体而言，细胞壁降解酶的种类非常丰富，且一些细胞壁降解酶在大丽轮枝菌致病过程中发挥着重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相关的致病基因

大丽轮枝菌具有微菌核的休眠结构，微菌核能够在土壤中存活数10年甚至20年以上。微菌核多呈椭圆形，具有瘤状凸起，由单根或数根菌丝经分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌丝芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良环境。微菌核是自然界最初的侵染源，当外界自然环境适宜时植物的根系分泌物会诱导微菌核萌发形成菌丝，菌丝附着在寄主植物的根部，并可以从根部表皮破裂处侵入植物体内。大量研究表明，大丽轮枝菌微菌核的形成与致病力呈正相关。

丝状真菌会分泌包含8个半胱氨酸残基保守结构域（约100个氨基酸）的小分子量蛋白质，由于其疏水性能被称为疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附着、侵染结构的形成和有性生殖等很多方面都发挥着重要功能。VDH1是大丽轮枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突变株产微菌核的能力显著下降，分生孢子耐干燥环境的能力降低，但致病性并没有明显变化。相对于菌丝融合阶段和分生孢子形成阶段，VDH1在微菌核形成阶段的表达量更高[14]。这表明VDH1基因参与微菌核的形成，与大丽轮枝菌的长期存活有关。

烟曲霉中Aayg1基因是与黑色素合成相关的基因，大丽轮枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突变体中黑色素的产生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突变体中与黑色素生物合成相关的一些基因的表达下调，但疏水蛋白基因VDH1的表达并没有发生改变。

谷氨酸富集蛋白的编码基因（VdGARP1）突变体微菌核的产生受到显著抑制，产孢能力和生长速度降低，致病力下降。但在极其贫瘠的营养环境下，其突变体也能够形成微菌核，说明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推测VdGARP1在微菌核的初始形成阶段发挥重要的作用[16]。Rauyaree等[17]从大丽轮枝菌中克隆到VMK1，该基因编码一个促分裂原蛋白激酶（MAPK），研究表明该基因影响微菌核的形成。转录因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均参与大丽轮枝菌的黑色素合成途径，VdCmr1可以调节一些黑色素合成相关基因的表达，以增强大丽轮枝菌对紫外线或高温等一些非生物威胁的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中参与二羟基萘黑色素合成途径，大丽轮枝菌的同源基因VdPKS1的缺失会影响乙烯合成、黑色素形成和致病性等相关基因的表达，其突变株可以产生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相关基因VdPR3的缺失突变体菌丝生长速度和产孢能力下降，微菌核的产生受到抑制，纤维素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一个多功能基因，参与了菌丝的生长发育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物学功能[20]。

RNA-Seq分析产微菌核菌株和不产微菌核菌株的基因的表达[21]，得到200多个差异表达基因，其中包括参与黑色素合成途径的一些基因（如聚酮合成酶、THN还原酶、漆酶等），还有一些未知蛋白基因。这说明产微菌核和黑色素的过程是受多基因调控的。

1.4 其他致病基因

1.4.1 转录调控基因。

与自然界所有有机体一样，植物病原菌在侵染植株的过程中也对周围环境的变化作出相应的应答反应，信号转导途径在此过程中起重要作用。真菌经典的信号转导途径包括促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、G蛋白介导的信号通路和环腺苷酸（cAMP）信号通路。大丽轮枝菌的致病过程与这些信号通路存在密切的关系[22-23]。信号转导过程如下：当识别受体结合相应的激发子后结构发生变化，随后激活一个或多个下游基因，导致下游基因的表达以及有机体的响应。MAPK信号通路调控病原菌的生理过程（如菌丝的定向生长和附着生长、侵染结构的形成、毒素的分泌等）。MAPK信号通路较为保守，包括3种激酶（MAPKKK、MAPKK和MAPK），通过每级的磷酸化将信号传递给下游应答分子。cAMP 信号通路与MAPK信号通路协作，调控真菌对环境的适应、真菌的生长发育、毒力蛋白的表达等[24-25]。G蛋白介导的信号通路调控病原菌的细胞壁降解酶、碳代谢、次级代谢物的合成等[26]。在大丽轮枝菌中，MAPK家族基因VMK1的缺失突变体产孢量降低，微菌核的形成减少，同时在莴苣和番茄上的毒力下降[17]。位于MAPK信号通路上游的编跨膜粘蛋白基因Msb的缺失突变后，产孢量和微菌核的形成减少，侵染能力和附着能力也大大降低[27]。cAMP信号通路中，大丽轮枝菌的基因VdPKAC1是编码cAMP依赖的蛋白激酶 A（cAMP-dependent protein kinase A，PKA）的催化亚基，VdPKAC1的缺失突变体虽然没有影响大丽轮枝菌的根部侵染能力，但引起了致病力的显著下降[22]。在G 蛋白介导的信号通路中，大丽轮枝菌的G蛋白β亚基（VGB）缺失突变株的致病力下降，生长表型也会受到影响，微菌核和孢子的产量增加[23]。

真菌转录因子（TFs）在许多植物病原菌中被证实具有调控植物病原菌毒力相关基因表达的功能。大丽轮枝菌中含有一个具有真菌转录因子结构域的基因VdFTF1，通过构建 VdFTF1缺失突变体，发现突变体生长速度、孢子形态以及黑色素产生都没有改变，但突变体的致病力显著下降。转录组测序分析发现，VdFTF1对 802 个基因具有表达调控作用，其中包括分泌蛋白、碳水化合物降解酶和一些致病关键因子。进一步研究表明，VdFTF1通过调控细胞壁降解酶的合成来影响大丽轮枝菌的致病过程[28]。

转录因子Crz1是真菌中 Ca2+信号转导的重要下游调控因子，转录因子Crz1含有2个典型的C2H2锌指，并作为Ca2+信号转导的主要介质来调节钙调磷酸酶依赖性基因的表达。转录因子Crz1的同源物在许多真菌中被鉴定，参与了孢子形成、信号转导、致病性等重要的生物学功能。对大丽轮枝菌中Crz1的同源基因VdCrz1进行研究，发现VdCrz1基因参与大丽轮枝菌微菌核的形成、Ca2+信号的传导和病原菌的致病性[29]。大丽轮枝菌中的转录调节子VdSge1的缺失能够导致其在番茄寄主上的毒力下降，并可以使得菌丝颜色由白色变为棕色，产孢量降低[30]。

转录因子Vta2可以调控一些附着蛋白的表达，以此控制其对番茄寄主的根部侵染和定殖，该基因的缺失突变株导致病原菌在寄主根部不能定殖，并使得其致病力降低[31]。转录因子Som1和Vta3在大丽轮枝菌的根系渗透和寄主定殖方面发挥着重要作用。Som1调控菌丝的生长发育，病原菌的根部附着、侵入以及定殖以及Vta3基因的表达。Som1和Vta3共同调控着致病性所必需的整个基因表达体系[32]。

这些转录调控因子在大丽轮枝菌致病过程中均发挥着重要作用，形成一个复杂的病原菌致病的调控体系。

1.4.2 毒蛋白基因。

大丽轮枝菌在侵染过程中会分泌一些可导致寄主植株萎蔫甚至死亡的毒性蛋白，研究表明黄萎病菌致萎毒素主要是酸性糖蛋白，糖蛋白毒素能够水解和破坏植物的細胞膜，引起细胞渗透压的变化及物质的渗出，最终导致植物发病。大量试验表明，大丽轮枝菌分泌的毒力蛋白包括一些胞外分泌蛋白、细胞壁水解酶、富含半胱氨酸的小分子量蛋白、赖氨酸蛋白等[6]。研究人员在大丽轮枝菌中发现一个编码毒性蛋白的基因VdNEP[33-35]，与真菌中的坏死与乙烯诱导蛋白的序列具有高度同源性。研究表明，坏死与乙烯诱导蛋白VdNEP 具有产毒素和诱导的双重功能。VdNEP 蛋白能够导致烟草叶片萎蔫坏死、激活拟南芥中的水杨酸和乙烯依赖的防御途径以及诱导棉花中抗毒素的产生。进一步研究发现，大部分大丽轮枝菌菌株含有8～9个VdNLP（NEP-like protein）家族成员，其中只有VdNLP1和VdNLP2可以诱导拟南芥、番茄、棉花、烟草的坏死和防御反应的发生，编码VdNLP1的基因就是所鉴定VdNEP的同源基因，VdNLP1基因的缺失并不影响菌株的致病力，但营养生长的表型发生改变，突变体会产生更多的气生菌丝和更少的分生孢子。VdNLP2基因的缺失不改变菌株的营养生长表型，但能够降低菌株在番茄和拟南芥上的毒力。大丽轮枝菌的VdCP1基因编码的蛋白属于 SnodProt1 植物毒素家族[36]，会激活寄主植株的防御反应，缺失VdCP1基因的突变体的致病力较野生型有所降低。分泌蛋白VdLHS是内质网 Hsp70 家族蛋白，LHS蛋白在稻瘟病菌能够调控多种蛋白的分泌。缺失 VdLHS基因后大丽轮枝菌的胞外蛋白分泌量下降76%，致病力也显著下降[7]。

1.4.3 效应因子。

在植物和大丽轮枝菌互作的过程中，一方面，植物通过识别病原菌产生的一些分泌物质来启动自身的免疫防御反应，以阻止病原菌的入侵;另一方面，大丽轮枝菌会编码一些蛋白应对植物的免疫防御反应，达到侵染的目的。几丁质是真菌细胞壁的重要组分之一，病原菌所释放的几丁质寡糖被寄主的膜受体CERK（receptor chitin elicitor receptor kinase）识别，从而诱发寄主的免疫防御反应。为应对这种防御反应，真菌病原菌会产生效应物LysM，它可以阻止植物识别几丁质寡糖，从而抑制植物免疫反应[37-38]。研究人員通过比较基因组学在大丽轮枝菌基因组中找到一个特定谱系（LS）基因区域，在这个区域内发现7个编码 LysM效应子的基因（VDAG_00902、VDAG_03096、VDAG_04781、VDAG_06426、VDAG_06998、VDAG_08171、VDAG_05180），其中VDAG_05180 基因所编码的蛋白能够结合几丁质寡糖，抑制寄主植物体内免疫信号的传递和防御反应。VDAG_05180基因的缺失能够导致菌株的致病力显著下降，说明VDAG_05180基因在大丽轮枝菌致病过程中发挥着重要作用[39]。特异蛋白VdSCP7被认为大丽轮枝菌中调节植物免疫的一种新型效应蛋白，其定位在植物细胞核中，通过识别VdSCP7蛋白，植物的水杨酸和茉莉酸信号途径被激活[40]。

最新的研究发现大丽轮枝菌中的聚多糖脱乙酰酶基因（VdPDA1）的缺失突变体能够显著降低大丽轮枝菌的毒力。在碱性的体外环境中VdPDA1对可溶性几丁质寡糖具有很强的脱乙酰酶活性。研究表明，VdPDA1在大丽轮枝菌的侵染早期表达，并在病原菌-寄主侵染界面的菌丝颈处大量积累，VdPDA1通过对几丁质寡糖的去乙酰化，使得几丁质寡糖不能被植物寄主的受体所识别，抑制了寄主的免疫反应[41]，揭示了一种新型的致病机制。

1.4.4 无毒基因。

1954年，Flor根据亚麻和亚麻锈病之间的抗病性研究结果，提出了基因-基因学说，即寄主植物中含有抗性基因或感病基因，而病原菌中含有毒性基因或无毒基因，当含无毒基因的病原菌与含抗病基因的寄主发生互作时，无毒基因（avirulence gene，Avr）被抗性基因所识别，激发寄主的免疫反应，寄主表现为抗病，而其他的组合中寄主表现为感病。大丽轮枝菌1号生理小种上的一个片段大小为50 kb的无毒基因Ave1被鉴定，该基因能够被番茄中抗性基因 Ve1基因蛋白所识别，从而激活了番茄中Ve1基因介导的抗性反应。基因进化分析表明，Ave1是由植物水平转移而来[42]。

1.4.5 激发子。

激发子在病原菌与植物寄主的相互作用以及信号转导中有重要的作用。激发子是一类小分子物质，包括寡多糖、多肽、蛋白、糖蛋白、磷脂和多糖[43]。激发子在低浓度条件下能够激活植物防御应答的能力，说明寄主植物上存在受体与之结合，并能够激活下游的一系列信号反应。激发子在病原菌与植物寄主的相互作用以及信号转导中起着很关键的作用，大丽轮枝菌中VdNEP[29]和VdPevD1[44]具有诱导作用，被证实为激发子，能够激活寄主植物的免疫反应，并参与棉花与大丽轮枝菌的互作。另外，大丽轮枝菌释放的线粒体DNase 作为激发子，除了对宿主马铃薯具有诱导活性外，对非宿主豌豆也具有诱导抗性的能力。纯化的 VdDNase 能够诱导豌豆果皮中豌豆素和病程相关基因PR-10的表达，通过这种对非宿主植物DNA的改变和损伤，激发非宿主植物的免疫抗性反应[45]。

1.4.6 转运蛋白。

转运蛋白对于真菌的致病过程中也发挥着重要作用，一些转运蛋白与真菌的抗药性有关，有些转运蛋白基因的突变会导致病原真菌无法将毒素转运到寄主体内[46]。超家族转运蛋白（primary facilitator superfamily transporter，MFS）在真菌的抗药性方面发挥着重要作用[47]。VdATMT-136是T-DNA插入到MFS基因（VDAG_09647.1）的突变体[48]，与野生型相比，该突变体不能引起莴苣的萎蔫症状，说明MFS基因与致病力相关，突变体的研究对于研究真菌的耐药或耐抗菌物质的特性具有重要意义。硫胺转运蛋白VdThit基因的缺失突变体的生长速度、产孢量和致病力都有所下降，外源补充硫胺素后这些生物学功能会得到部分恢复。分析显示，突变体中丙酮酸代谢受到抑制[49]。

2 致病相关基因筛选的策略

2.1 突变体库中的构建

利用突变体库的建立得到致病力缺陷突变体，已经成为获得致病基因的研究热点。利用农杆菌介导转化（agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）方法构建真菌突变体库已用于50多种真菌，即利用标记片段T-DNA进行随机插入获取大量的突变体，从中筛选致病力缺陷的突变体，采用反式PCR（Inverse-PCR）或TAIL-PCR 方法获得 T-DNA 插入位点侧翼序列并分析突变位点。ATMT方法已经被成功用于大丽轮枝菌的遗传转化、基因定点突变和功能研究[50]。Maruthachalam 等[48]构建了莴苣黄萎病菌 VdLs.17 的 T-DNA 插入突变体库，并从获得的181个突变体中筛选出一些致病力显著下降的突变体，鉴定出内切葡聚糖酶VdEg-1（endoglucanase1）、羟甲基戊二酰辅酶 A合成酶VdHMGS（a hydroxyl-methyl glutaryl-Co A synthase）、超家族转运蛋白 VdMFS1（a major facilitator superfamily 1）和糖基化磷脂酰肌醇转移酶 VdGPIM3（a glycosylphosphatidylinositol mannosyltransferase）等致病相关基因。徐荣旗等[51]构建了大丽轮枝菌Vd991的 T-DNA 插入突变体库，获得了在 PDA 培养基上不同生长表型的突变体。Gao等[16]通过构建落叶型大丽轮枝菌V592的T-DNA 插入突变体库，验证了一些基因的功能，如与微菌核形成相关的基因GARP1，与致病性相关的基因DVK1等。

2.2 同源基因的克隆

根據已报道或已克隆其他病原菌的致病相关基因，在大丽轮枝菌基因组中找到相应的同源基因，通过基因敲除的方法获得突变体，将突变体与野生型菌株的生长表型和致病力进行比较，进而判断基因的功能。比如，影响大丽轮枝菌致病力的蔗糖非发酵蛋白激酶基因VdSNF1[12];影响微菌核的形成和致病力的MAPK家族基因VMK1[9];影响大丽轮枝菌营养生长和致病力的坏死和乙烯诱导蛋白基因[29]。

2.3 致病性鉴定方法

将相关基因敲除或者过量表达获得突变体是研究基因功能的基本方法，通过鉴定突变体的致病能力来验证基因的功能，就需要建立快速、有效的鉴定方法。以棉花为寄主，目前鉴定菌株致病力的方法主要有田间病圃鉴定法和温室苗期鉴定法。田间病圃鉴定法由于易受到多方面环境因子和季节的影响，一般不予采纳。温室苗期鉴定法主要有针刺接菌法、纸钵撕底法、无底塑钵菌液浇根法、蛭石沙土无底纸钵定量蘸菌液法、毒素鉴定法等[52-53]。温室苗期鉴定法不受时间和季节的限制，可以开展规模化工作，但容易出现接菌不均一、周期长等方面的问题。

农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室建立了一种大丽轮枝菌的致病力鉴定的新方法。用棉花基质育苗至2片真叶，将幼苗从基质中取出，裸根接种大丽轮枝菌的孢子液后，又重新移栽无土基质中。这种方法的优点在于：①棉苗根系与病菌充分的接触，保证伤根均匀;②此方法鉴定快速，一般接种后7～10 d就能出现症状，缩短了鉴定周期。

3 总结与展望

研究大丽轮枝菌致病相关基因以及致病机理具有重大的理论和实际意义。一方面，从已克隆的致病基因的功能来看，有些致病基因除影响病原菌的致病力外，还对营养体和休眠体的结构产生影响，如孢子的产量、菌丝的产生、微菌核和黑色素的形成等，因此研究病原菌的致病基因可以为研究病原菌的长期存活与演化提供依据。另一方面，通过研究大丽轮枝菌的致病基因及所编码的蛋白，将有助于弄清病原菌一些关键的生化途径和信号途径，揭示病原菌和寄主的相互关系和互作机制，进而深入的解析致病机制，为开发新型农药或者有针对的使用农药防治该病害奠定基础。

大丽轮枝菌的致病过程是一个多基因调控的结果，是一个复杂的网络调节系统。对致病基因和致病机理进行更加深入的研究，将有助于找到控制病害的有效方法。

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