薄荷润唇膏微生物指示菌挑战性试验研究*

滕宝霞,牟建平,贺晓文

(甘肃省药品检验研究院,甘肃 兰州 730070)

薄荷润唇膏主要成分为：矿油、地蜡、矿脂、甲氧基肉桂酸乙基乙酯、水杨酸乙基乙酯、羊毛脂、薄荷醇、樟脑、蓝桉叶油、欧洲赤松叶油、水杨酸甲酯。由于含有大量油、酯类物质，按化妆品微生物检验[1]中常规的检验方法，制备的供试液不能形成均匀的混悬液，薄荷润唇膏中含有薄荷醇[2]、水杨酸乙基乙酯成分[3]，对部分质控菌有一定的抑制作用。进行指示菌挑战性试验，通过计数方法回收率、控制菌生长试验，建立薄荷润唇膏微生物检验方法。

1 试验材料

1.1 薄荷润唇膏

曼秀蕾敦(中国)药业有限公司，生产许可证号：XK16-108 1377，卫妆准字29-XK-0649 ，国妆特字G20100002，有效期：2020年10月。

1.2 培养基

卵磷脂吐温80营养琼脂，批号：190221；SCDLP液体培养基，批号：180202；孟加拉红琼脂，批号：180119；双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)，批号：180609；Baird-Parker培养基，批号：190122；甘露醇发酵培养基，批号：180811；伊红美蓝琼脂(EMB)，批号：190827；十六烷三甲基溴化铵琼脂，批号：190813；pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液，批号：20200312。均购于北京陆桥技术股份有限公司。

1.3 菌种

大肠埃希菌〔ATCC8739〕、铜绿假单胞菌〔ATCC 27853〕、枯草芽孢杆菌〔ATCC 6633〕、金黄色葡萄球菌〔ATCC6538〕、白色念珠菌〔ATCC10231〕和黑曲霉〔ATCC16404〕。购于中国食品药品检验研究院。

1.4 设备

超净工作台(厂家：苏州苏净、型号：SW-CJ-2D型)、生物安全柜(厂家：ESCD、型号：CLASS11BSC)、生化培养箱(厂家：上海一恒、型号：BPMJ-250F)、压力消毒器(厂家：松下、型号：MSL-3781L-PC)、恒温水浴锅(厂家：杭州米欧仪器有限公司、型号：WT100-2)、电冰箱(厂家：江苏白雪、型号：6C13080177)、显微镜(厂家：奥林巴斯、型号：BX53+DP74)、电热恒温干燥箱(厂家：北京科伟永兴仪器有限公司、型号：101-3AB)、天平(厂家：诸暨超泽、型号：JMA5001)。

2 方法与结果

2.1 菌种

试验所用菌种为第3代，菌悬液为第4代。

2.2 供试液制备

取薄荷润唇膏 5 g 加到灭菌的三角瓶中，加入 5 mL 灭菌吐温-80，加入pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液至 100 mL,置于 45 ℃ 水浴中，溶解，用匀浆仪混匀3 min，制成1∶20 g/mL供试液。

2.3 计数方法试验(1)

1)试验组取1∶20 g/mL供试液，分别加入5种试验菌株(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉)的菌悬液，制成含菌数小于 100 cfu 的供试液，取含菌的样品溶液 1 mL，每个菌液注2个平皿，注入所需培养基，培养、计数。

2)菌液对照组分别取5种实验菌的菌悬液(50～100cfu)1 mL 注皿，加培养基、培养、计数。

3)供试品对照组用供试品替代实验组液体注皿，实验。

4)阴性对照组用同批配制、灭菌的SCDLP 1 mL 替代样品注皿，注入培养基、培养、计数。计数方法试验(1)的结果见表1。

表1 薄荷润唇膏计数方法(1)挑战性试验

结果，采用1∶20 g/mL的供试液 1 mL 注皿，金黄色葡萄球菌的回收率小于50%，方法不可行。

2.4 计数方法试验(2)

将供试液1∶20 g/mL稀释成1∶50 g/mL和1∶100 g/mL，加入金黄色葡萄球菌的菌悬液，进行挑战性试验。计数方法试验(2)的结果见表2。

表2 薄荷润唇膏计数方法(2)挑战性试验

结果，细菌总数采用1∶50 g/mL的供试液 1 mL 注皿，霉菌和酵母菌总数采用1∶20 g/mL的供试液 1 mL 注皿，回收率试验满足指示菌挑战性试验要求，检验方法可行。

2.5 铜绿假单胞菌检验方法挑战性试验

1)试验组。取薄荷润唇膏 1∶20 g/mL的供试液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液体培养基到灭菌的三角瓶中，加入铜绿假单胞菌菌悬液 1 mL(小于 100 cfu)，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行试验。

2)阳性对照。 将铜绿假单胞菌菌悬液 1 mL(小于 100 cfu)加到 100 mL SCDLP液体培养基，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验；同时测定铜绿假单胞菌菌悬液菌数。

3)供试品对照组。取薄荷润唇膏1∶20 g/mL的供试液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液体培养基到灭菌的三角瓶中，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行试验。

4)阴性对照。同批配制、灭菌， 100 mL SCDLP液体培养基，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验。

铜绿假单胞菌方法适用性试验结果，见表3

表3 薄荷润唇膏——铜绿假单胞菌方法适用性试验

结果表明，采用《化妆品安全技术规范》2015年版铜绿假单胞菌常规方法进行试验，可以检出试验菌-铜绿假单胞菌，方法可行。

2.6 金黄色葡萄球菌检验方法挑战性试验

2.6.1 常规方法

1)试验组。取薄荷润唇膏1∶20 g/mL的供试液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液体培养基到灭菌的三角瓶中，加入金黄色葡萄球菌菌悬液 1 mL(小于100 cfu)，按《化妆品安全技术规范》2015年版金黄色葡萄球菌检查项进行试验。

2)阳性对照将金黄色葡萄球菌菌悬液 1 mL(小于 100 cfu)加到 100 mL SCDLP液体培养基，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验；同时测定金黄色葡萄球菌菌悬液菌数。

3)供试品对照组取薄荷润唇膏1∶20 g/mL的供试液 20 mL 加入 100 mL SCDLP液体培养基到灭菌的三角瓶中， 按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行试验。

4)阴性对照同批配制、灭菌 100 mL SCDLP液体培养基，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验。

金黄色葡萄球菌方法适用性试验(常规法)结果，见表4。

表4 薄荷润唇膏控制菌——金黄色葡萄球菌方法适用性试验(常规法)

结果表明，采用《化妆品安全技术规范》2015年版金黄色葡萄球菌的常规方法进行试验，未检出试验菌-金黄色葡萄球菌，方法不可行。

2.6.2 培养基稀释方法

试验组、阳性对照、供试品对照组和阴性对照组SCDLP液体培养基的体积采用 300 mL 进行金黄色葡萄球菌 的生长实验，结果见表5。

表5 薄荷润唇膏控制菌——金黄色葡萄球菌方法适用性试验(培养基稀释法)

结果表明，参照《化妆品安全技术规范》2015年版和《中国药典》2015年版1106金黄色葡萄球菌检验方法，增加培养基体积，进行挑战性实验，检出试验菌-金黄色葡萄球菌，方法可行。

2.7 耐热大肠菌群检验方法挑战性试验

1)试验组。取薄荷润唇膏1∶20 g/mL的供试液 20 mL 加入 20 mL 双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)到灭菌的试管中，加入大肠埃希菌菌悬液 1 mL(小于 100 cfu)，按《化妆品安全技术规范》2015年版耐热大肠菌群检查项进行试验。

2)阳性对照。将大肠埃希菌菌悬液 1 mL(小于100 cfu)加到 20 mL 双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验；同时测定大肠埃希菌菌悬液菌数。

3)供试品对照组。取薄荷润唇膏1∶20 g/mL的供试液 20 mL 加入 20 mL 双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)到灭菌的试管中，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行试验。

4)阴性对照。同批配制、灭菌 20 mL 双倍乳糖胆盐培养基(含中和剂)，按《化妆品安全技术规范》2015年版的要求进行检验。

耐热大肠菌群方法适用性试验结果，见表6。

表6 薄荷润唇膏控制菌-耐热大肠菌群方法适用性试验

结果表明，采用《化妆品安全技术规范》2015年版耐热大肠菌群的常规方法进行试验，可以检出试验菌-大肠埃希菌，方法可行。

3 结论

1)薄荷润唇膏由于含有大量脂溶性基质，不易制备成均匀的混悬液。由于薄荷润唇膏对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，细菌采用 1∶50 g/mL的供试液注皿，真菌采用1∶20 g/mL 的供试液注皿，试验回收率达到 70%以上，挑战性试验成功，检验方法可行。

2)按规范方法，进行指示菌挑战性试验，控制菌满足要求，金黄色葡萄球菌采用培养基稀释方法，可以通过挑战性试验，表明检验方法可行。