高效液相色谱法分析N-月桂酰基苏氨酸

尹逗逗 方银军 刘雪锋

(1.江南大学化学与材料工程学院 合成与生物胶体教育部重点实验室，江苏无锡，214000；2.赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州，310030)

氨基酸表面活性剂是一类以可再生物质为原料的环境友好型表面活性剂，具有低毒、易生物降解的优点[1-3]，且皮肤刺激性小[4-5]，配伍性能好[6-8]，与脂肪酸皂相比具有更好的硬水稳定性，现已广泛地应用于日用化学品配方中[9-12]。工业上大多以肖顿-鲍曼缩合法合成氨基酸表面活性剂[13-15]，生产过程中难以避免酰氯的水解，而产物纯度对应用性能有直接的影响，因此，建立其纯度分析方法对氨基酸表面活性剂的品质控制和应用具有重要的意义。

阴离子型的氨基酸表面活性剂在分子结构上与脂肪酸相近，属于羧酸类化合物，须在碱性条件下才能抑制水解。为确保滴定的准确性，应选择适用于碱性条件的指示剂滴定。似乎可以采用适用于皂类表面活性剂的溴甲酚绿碱性两相滴定法[16-17]进行阴离子型氨基酸表面活性剂的定量分析。本文以N-月桂酰基苏氨酸(C12Thr)为例，对其进行溴甲酚绿两相滴定法纯度分析。在滴定过程中发现乳化严重、破乳困难，严重干扰了滴定终点的判断。进而，采用高效液相色谱(HPLC)法(示差折光检测器)对C12Thr样品进行了定量分析。相比两相滴定法，HPLC法更为直观、快速和简便。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

N-月桂酰基苏氨酸，自制；溴甲酚绿，AR，上海化学试剂总厂试剂三厂；十二水磷酸氢二钠，AR，国药集团化学试剂有限公司；无水磷酸钠，AR，国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，AR，国药集团化学试剂有限公司；十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)，AR，国药集团化学试剂有限公司；海明1622，97 %，北京伊诺凯科技有限公司；甲醇，HPLC，阿达玛斯试剂有限公司；月桂酸，RG (99%以上)，阿达玛斯试剂有限公司。Agilent 1100型高效液相色谱仪 (示差折光检测器) ，美国安捷伦公司；KQ-100B 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 两相滴定分析

分别以海明1622和CTAB(浓度均为4.00×10-3mol·L-1)为滴定剂、以溴甲酚绿为指示剂进行两相滴定分析[16-17]。预先用NaOH中和C12Thr得到N-月桂酰基苏氨酸钠(C12ThrNa)试样，配制100 mL 1.00×10-2mol·L-1的试液溶液。移取10 mL试样溶液于100 mL具塞量筒中，并向其加入指示剂25 mL、氯仿15 mL和1.00 mol·L-1NaOH溶液1 mL，滴定间隙剧烈振摇，滴定过程中上层蓝色开始转移至下层，记录所加滴定剂的体积V1；放慢滴加速度至上层蓝色完全转移至下层时，记录所加滴定剂的体积V2；继续滴定至两相立即破乳，记录所加滴定剂的体积V3。平行滴定3次，取平均值。空白实验可观察到两相立即破乳，蓝色快速完全转移至油相，记录所加滴定剂的体积V0。

试样中阴离子表面活性剂的质量分数x为：

式中，c为阳离子滴定剂的浓度(mol·L-1)，Vi分别为V1、V2和V3，其中，V1为滴定过程中油相出现蓝 色时滴定剂的体积(mL)，V2为滴定过程中上层蓝色完全转移至下层时滴定剂的体积(mL)，V3为两相立即破乳时滴定剂的体积(mL)，V0为空白实验所消耗的滴定剂体积(mL)，M为待测表面活性剂的摩尔质量(g·mol-1)，m为待测表面活性剂的质量 (g)。

1.2.2 HPLC分析

(1) 色谱条件

色谱柱：Hedera ODS-2 C18反相柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm) ；检测器：示差折光检测器；流动相：甲醇 (超声脱气) ；流速：0.6 mL·min-1；柱温：35℃；进样量：40 μL。该色谱条件下可实现C12Thr和LA两者之间基线分离。

(2) C12Thr和LA的工作曲线和最低检测限

以色谱甲醇为溶剂分别配制一系列不同浓度的C12Thr和LA溶液，得到色谱流出曲线，绘制C12Thr和LA的色谱峰面积(A)与浓度(c, g·L-1)关系图，确定线性范围[18-19]。将试样溶液按梯度稀释，将S/N(信噪比) = 3时所对应的浓度作为检测限[20]。

(3) 精密度和空白加标回收实验

取一定浓度的C12Thr和LA溶液，分别连续进样5次，记录峰面积，并计算其 RSD 值。按照线性范围内低、中、高3种浓度，向空白样品中加入待测物质，每个样品测3次，记录峰面积，取平均值。

加标回收率 ＝ 试样测定值/理论值×100 %。

2 结果与讨论

2.1 两相滴定

两相滴定是根据两相颜色变化来判断滴定终点，进而计算表面活性剂纯度或含量的一种方法。在滴定过程中，滴定剂首先与待测物在水中发生定量化学反应，形成难溶于水的阴阳离子缔合物进入油相；达到等当点后，过量的滴定剂与指示剂缔合使水相颜色转移至油相，即可判为滴定终点[16-17,21]。我们发现海明1622滴定C12ThrNa的过程中产生明显的乳化现象(见图1)。

分别在滴定至氯仿相刚出现蓝色和水相颜色全部转移至氯仿相时进行了观察，当海明1622滴定至氯仿相刚出现蓝色时，乳化体系静置 2.5 h后仅有少许油相析出（见图1a），两天后体系仍未完全破乳，此时C12ThrNa的滴定含量仅约为76%（见表1）；继续滴定至氯仿相颜色明显加深、乳化层颜色明显消退 (这个现象需要约17 h方可清楚观察到，图1b)，体系中的乳化现象依然严重，静置48 h后才观察到完全破乳，此时水相的蓝色全部转移至氯仿相（见图1b），此时C12ThrNa的滴定含量约为90%（见表1）；继续滴定至体系 1 min内破乳，此时C12ThrNa的滴定含量约为 98%（见表1）。

考虑到C12ThrNa的亲水基体积较大，而海明1622分子结构中存在两个乙氧基(EO)基团，有可能导致海明1622与C12ThrNa形成的阴阳离子缔合物具有明显的两亲性，进而导致明显的乳化现象。为排除海明1622分子结构中EO基团可能带来影响，选择用CTAB作为滴定剂再次进行滴定分析。出乎意料的是，用CTAB滴定时体系中严重的乳化现象依然存在(滴定数据见表1)，说明该乳化现象并非完全由海明1622分子结构上的EO基团所致。

图1 以海明1622滴定C12ThrNa

表1 C12ThrNa的两相滴定数据结果

由此推测：C12ThrNa的亲水头基过大，与阳离子表面活性剂的缔合过程有较明显的空间位阻效应，使得C12ThrNa与滴定剂形成的阴阳离子缔合物具有明显的两亲性，致使滴定过程中尤其是临近滴定终点时产生明显的乳化现象，严重干扰了滴定终点的判断。

值得指出的是，这种乳化现象可以通过局部滴加短链醇或添加中性强电解质无机盐等方法予以破乳，但是面临着导致滴定分析结果出现明显偏差的风险。

2.2 HPLC法

为简便处理，采用以C12Thr为分析样进行HPLC色谱条件建立和具体分析。采用甲醇为流动相，Hedera ODS-2 C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱。流动相流速为0.6 mL ·min-1时，LA和C12Thr可实现基线分离(见图2)。 其中，LA的保留时间t约为9.66 min，C12Thr的保留时间t约为7.53 min；在LA-C12Thr混合样中，LA和C12Thr的保留时间t与单独样相比没有明显的偏移，两者之间实现很好的基线分离。与前文所述两相滴定法相比，HPLC法可以在15 min内很好地分离LA和C12Thr，极大地减少了检测时间；不仅如此，两相分析法所得结果为总阴离子表面活性剂含量，而HPLC法可以更加精准地得到可能存在的原料酸和目标氨基酸表面活性剂的具体含量。

图2 LA与C12Thr的HPLC流出曲线图

以质量浓度c为横坐标，流出曲线峰面积A为纵坐标绘制工作曲线(图3)，进行线性回归分析。如图3a所示，LA的浓度在6.49×10-3～8.64×10-2g·L-1范围内时，峰面积A与浓度c之间存在良好的线性关系，其线性方程为：A＝2.14×105c＋4.43×102，线性相关系数R2为0.9993；如图3b所示，C12Thr的线性范围浓度为：6.07×10-2～1.62 g·L-1，线性方程为：A＝2.41×105c＋1.98×103，R2为0.9985。

图3 LA (a) 和 C12Thr (b) 的工作曲线

根据S/N(信噪比)＝3时所对应的待测样浓度[20]，得出LA和C12Thr的检测限分别为4.12×10-3g·L-1和4.32×10-3g·L-1，说明该方法具有较好的灵敏度。

用上述方法对实验实际合成所得C12Thr的含量分析结果见表2。由于缺乏标准样，C12Thr的面积归一化含量为(99.27±0.08)%。采用外标法[18-19,22]检测到样品中LA含量为(1.02±0.11)%，进而得出C12Thr含量为(98.98±0.11)%，所得结果与两相滴定法(见表1) 比较接近。

表2 C12Thr的含量 %

表3 LA和C12Thr的精密度测试

表4 LA和C12ThrNa的加标回收实验

LA和C12Thr的精密度测试结果见表3，LA和C12Thr样品的RSD均小于2%，数据的重现性较好。

LA和C12Thr的空白加标实验结果见表4，LA的空白加标回收率为(99.47±0.16)%，RSD为0.14%；而C12Thr的空白加标回收率为(99.55±0.18)%，RSD为0.16%。可见，加标回收实验结果较好。

3 结论

综上所述，建立了一种可快速同时检测C12Thr及其原料酸LA含量的HPLC分析方法。研究发现C12Thr线性范围为6.07×10-2～1.62 g·L-1，检测限为4.12×10-3g·L-1，空白加标回收率为99.55±0.18%；LA的线性范围在6.49×10-3～8.64×10-2g·L-1之间，检测限为4.32×10-3g·L-1，空白加标回收率为(99.47±0.16)%。与传统的两相滴定法相比，HPLC法所用试剂种类少、无需使用有毒溶剂、灵敏度较高，并极大地缩短了检测时间，整个检测过程可在15 min内完成。该分析流程的建立方法可为相关氨基酸表面活性剂生产企业的质量控制和生产工艺监控提供借鉴。