HPLC-RID法同时快速定量分析N-月桂酰基谷氨酸钠及副产物皂

裴壮壮 周凯强 胡学一 方 云* 孙 洋 李华山

（1. 江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡，214122；2. 南京华狮新材料有限公司，江苏南京，210009）

氨基酸型表面活性剂源于可再生资源，其疏水链与氨基酸可通过不同方式连接构成[1]。N-月桂酰基谷氨酸钠（SLG）的原料来源广泛、产品应用性能优异以及环境友好性佳[2-5]，已被广泛应用于个人清洁[6-8]、生物医药[9-10]、润滑[11]和缓蚀[12]等领域。SLG通常采用肖顿-鲍曼缩合工艺生产，即月桂酰氯与谷氨酸钠在碱性水/有机溶剂或水溶剂中反应[13-16]。由于月桂酰氯易水解而生成月桂酸皂（SLA），对产品性能造成影响[17]，因此需要建立同时快速分析方法，用于SLG的合成工艺开发、产品的品质监控及其应用研究。

表面活性剂的定量分析方法主要有两相滴定法、分光光度法、色谱法、示波极谱法和电化学分析法等[18]，其中两相滴定法[13,19]和液相色谱法（HPLC）[20-22]已被用于定量分析SLG产品。早期较多采用两相滴定法测定酰基氨基酸及皂的总量，再用繁琐的萃取称重法测定并扣除皂含量[13]，但难以满足快速分析需要。近期采用HPLC-紫外检测（UV）法定量分析了SLG，但由于皂缺少特征紫外吸收而难以同时定量分析[20]。HPLC-蒸发光散射检测（ELSD）法也被用于定量分析SLG[21]，然而其对漂移管温度（50 ℃）的要求过于苛刻，未能实现同时分析。衍生化HPLC-UV法成功解决了同时测定皂的难题，但衍生化操作繁琐，难以快速测定，且各种脂肪酸回收率不一。本文拟采用HPLC-示差折光检测（RID），建立同时快速准确定量分析SLG和SLA混合物的方法。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

月桂酰基谷氨酸（＞99.5 %，LG），实验室自制[5]；月桂酸(＞99.0%，LA)和乙酸乙酯（AR），上海泰坦科技股份有限公司；甲醇（HPLC）、甲酸（AR）和盐酸（AR），国药集团化学试剂有限公司；超纯水，采用美国Millipore Synergy UV超纯水系统自制；SLG产品A（粉体）、B（粉体）、C（液体）和D（液体）、椰油酰基谷氨酸钠（SCG）产品E（液体），市售。高效液相色谱仪（2695）、示差折光检测器（2414），美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 配制标准溶液

称取1 g（精确至0.1 mg）LG，用流动相定容至50 mL，再逐级稀释得到系列LG标准溶液；称取0.2 g（精确至0.1 mg）LA，用流动相定容至50 mL，再逐级稀释得到系列LA标准溶液。

1.2.2 市售样品溶液配制

称取0.4 g（精确至0. 1 mg，以干基计）各种SLG和SCG市售产品，加入10 mL水，用6 mol·L-1盐酸调节至pH＝1，再用20 mL乙酸乙酯分3次萃取，萃取液经旋转蒸发和干燥后备用。将上述前处理样品用流动相定容至25 mL，再经0.22 μm尼龙滤膜过滤后供HPLC分析。

1.2.3 液相色谱条件

色谱柱为WondaCract ODS-2 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本岛津公司)，流动相为体积比10 : 2 : 0.03的甲醇、超纯水和甲酸的混合溶液，单泵等度洗脱的流速为1.0 mL·min-1，柱温和检测器温度均为35 ℃。

1.2.4 市售产品总固含量测定

分别称取3份市售SLG液体产品3 g（精确至0.1 mg）或粉体产品1 g（精确至0.1 mg），在105℃下烘干至恒重后，根据样品失重量分别计算每份样品的总固含量，求平均值。

2 结果与讨论

2.1 标准工作曲线

图1为LG和LA的HPLC图，可以看出两者的保留时间分别为6.98 min和14.02 min，可以实现基线分离，并在15 min内完成一次进样分析。分别绘制LG和LA的标准工作曲线，如图2所示，线性回归方程和线性相关系数列于表1。以信噪比（S/N）≥3和S/N≥10的浓度分别为LG和LA的检出限和定量下限，结果也列于表1。在拟测定范围内，LG和LA的线性关系良好，其线性相关系数（R2）均高达0.9999，可满足定量分析需求。

图1 LG（a）和LA（b）的HPLC图

图2 LG（a）和LA（b）的标准工作曲线

2.2 方法准确度和精密度

SLG市售产品中加入LG或LA分别进行加标回收实验，结果见表2。高回收率和低相对标准偏差（RSD）的结果表明，该方法的准确度和精密度均较好，满足同时定量分析SLG和SLA。

表1 LG和LA的线性回归方程、检出限和定量下限

表2 加标回收率测定结果（n = 5）

2.3 市售产品的定量分析

2.3.1 样品未经前处理的尝试

SLG产品经酸化、萃取、蒸除溶剂和干燥等繁琐前处理的HPLC分析结果见图3（a）。为简化样品前处理流程和降低因产品转移损失的影响，尝试了体积比10 : 2 : 0.03的甲醇、超纯水和甲酸的混合溶液为流动相直接溶解样品进行HPLC分析，结果如图3（b）所示。除了简化前处理流程的样品因水分残留导致在保留时间为3.02 min处出现新峰外，图3（a）和3（b）中主要成分的保留时间和峰形均吻合。分别进行5组有无前处理流程的定量分析，结果表明，经前处理样品中SLG和SLA的含量是未经前处理流程的95.69～98.34 %和96.12～98.58 %，经前处理样品定量分析结果偏低，主要源于样品转移导致的损失。上述结果表明，简化前处理流程的HPLC法更具快捷和准确的特征，适用于快速准确定量分析SLG产品中SLG和SLA。

图3 经前处理（a）和未经前处理（b）样品的HPLC图

2.3.2 流动相中甲酸添加量的优化

考察了流动相中甲酸含量对SLG产品定量分析的影响，结果如图4所示。未添加甲酸时，产品中SLG和SLA主要以离子形式存在，与C18柱的固定相键合弱，导致保留时间短而难以分离和定量。添加的甲酸促进SLG和SLA的质子化而增强其与固定相的键合，当甲酸添加量增大到与甲醇的体积比为0.03 : 10时，继续增加甲酸添加量对保留时间、峰形以及峰面积几乎无影响，因此流动相优选体积比10 : 2 : 0.03的甲醇、超纯水和甲酸混合溶液。

图4 流动相中甲酸添加量对产品HPLC的影响

2.3.3 测定市售产品

图5 月桂酰基谷氨酸钠产品的HPLC图

采用优化的流动相直接溶解样品定量分析4种市售SLG产品，结果见图5。由图5和样品总固含量推算4种市售SLG产品中活性物SLG和SLA的含量，结果列于表3，SLA/SLG表明当前市售SLG产品中活性物和皂含量差异较大。采用优化的流动相直接溶解市售SCG产品定量分析SLG同系物和SLA同系物，结果见图6，其含量也以SLG和SLA为代表列于表3。由图6可知，SCG产品中的各成分达到基线分离，且主要含有SLG和SLA，表明该分析方法也可推广至定量分析天然脂肪酸为原料合成的其他N-脂肪酰基谷氨酸钠产品。

表3 市售产品的HPLC分析结果

图6 椰油酰基谷氨酸钠产品的HPLC图

3 结论

建立同时定量分析市售SLG产品中SLG和皂的反相HPLC-RID方法。采用WondaCract ODS-2 C18色谱柱以及体积比10 : 2 : 0.03的甲醇、水和甲酸混合溶液为流动相，可实现SLG与SLA基线分离，且线性相关系数均为0.9999，平均加标回收率分别为99.82%和98.91 %，RSD分别为0.84%和1.22%，定量下限分别为16.2 μg·mL-1和13.3 μg·mL-1。该方法适于快速准确定量分析SLG和SLA混合物，而且其分辨率足以推广至由混合脂肪酸为原料合成的其他N-脂肪酰基谷氨酸钠产品。