不同产区‘红灯’樱桃香气成分与产地生态因子相关性分析

邱 爽，刘 畅，谢美林，杨丽丽，魏阳吉 ，李景明,

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.中化现代农业有限公司，北京 100031）

食品香气即食品风味物质中一小部分具有致香活性的物质[1]，虽然它们仅占水果鲜重的0.01%～0.001%，但这些物质是影响果实品质的重要因素，也是吸引消费者和巩固市场的关键[2−3]。香气被认为是植物相互交流和与环境相互作用的重要物质。果实香气的形成受内在品种因素、外在环境因素（温度、光照、湿度等）以及人为因素（栽培及采后管理等）的共同影响[4]，而在这众多影响因素中，环境因素的影响最大[5−6]。Gachons等[7]研究发现长相思葡萄轻度缺水时的香气物质含量最高，但严重缺水会限制香气物质的积累。Deluc等[8]对赤霞珠和霞多丽葡萄的转录和代谢产物综合分析结果也同样表明长期和季节性缺水会影响葡萄果实的香气。光照也是影响果实香气合成的重要环境因子，如遮蔽光照可以通过抑制香气合成途径从而显著降低香气物质的含量[9−10]，紫外（UV-C）处理可以增加香气合成过程中关键酶的活性促进酯类香气的生成[11−12]。赵胜亭[13]研究香气含量与生态因子的相关性发现年积温、年降水量与苹果香气含量呈正相关关系，而海拔则与苹果的香气含量呈负相关。可见产地生态因子对果实香气的组成有着极其重要的影响。

樱桃（Cherry）是蔷薇科，李属类果实，在世界各地广泛种植[14]。樱桃中含有丰富的营养成分，具有极高的营养价值[15−17]。樱桃香气浓郁，其香气已被国内外大量研究和报道[18−20]。每个地域都具有独特的生态条件，即便同一果实品种在不同地区栽培，所产生的香气物质也有很大的差异[21−22]，而有关不同产区樱桃香气的研究还未见报道，更未涉及到特定地域精确环境因子对樱桃果实香气的影响。

樱桃的花期到果实成熟期一般为3月～5月，营养成分的积累也受到上一年气候条件的影响。基于以上研究背景，本研究对5个产区‘红灯’樱桃样品进行分析，包括西北地区（青海省、陕西省）、西南地区（四川省）、华北地区（山西省）、华东地区（山东省），跨度基本包括我国东、南、西、北，搜集5个产区2018年6月～2019年5月的气象情况，并利用GCMS技术对‘红灯’樱桃香气物质进行分析，通过主成分分析对5个产区‘红灯’樱桃的香气物质进行了区分，最后借助Pearson相关性分析及冗余分析等数学分析手段系统探讨了与樱桃香气物质的形成起显著影响的环境因子，旨在为选择合适的樱桃栽培地域提供理论参考，以提高樱桃的品种品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

5个产区‘红灯’樱桃 产地信息见表1；正构烷烃C7～C40、甲醇、乙醇 色谱纯，上海安普（Anpel）实验科技有限公司；无水乙醇、碳酸钠、氯化钠、PVPP、D-葡萄糖酸内酯 分析纯，北京百灵威科技有限公司；2-壬酮 色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司。

BSA124S-CW型分析天平 德国塞利多斯公司；RZ-708H型干磨料理机 荣事达公司；GL-20GII型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；Aglient 7890B型色谱仪、Aglient 5977B型质谱、HP-5MS UI 30×0.25 mm×0.25 μm毛细管色谱柱美国Agilent公司；聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯（DVB/CAR/PDMS）SPME萃取头 美国Supelco公司。

表1 ‘红灯’樱桃样品信息汇总Table 1 Summary of ‘Hongdeng’ cherry sample information

1.2 实验方法

1.2.1 样品的采集 樱桃样品采用随机取样法采样，随机选择6株生长一致的樱桃植株，按照商业成熟标准，从样株外围随机采果5 kg后用保鲜盒盛装，用带有冰袋的保温箱24 h内运输至实验室。挑选1 kg健康、大小和成熟度一致的果实，液氮快速冷冻后于−40 ℃储存，待分析。提取5个采样点的气象资料（包括年日照时数、大于0 ℃年积温、年降水量）及地形资料（海拔高度），气象数据来自中国气象科学数据中心网（http://data.cma.cn/）。

1.2.2 样品制备 参照Chen等[23]的方法操作：取出存于−40 ℃冰箱中的樱桃若干，液氮环境下去核初破碎，称取约30 g樱桃，依次加入0.60 g PVPP，0.30 g D-葡萄糖酸内酯后破碎成粉末，迅速转移至50 mL离心管中，于4 ℃冰箱保存4 h。4 h后取出样品于4 ℃、8000 r/min下离心15 min，取上清液，命名为澄清樱桃汁备用。

1.2.3 顶空固相微萃取（HS-SPME） 参考Villière等[24]的方法并加以修改。取5 mL澄清樱桃汁，加入10 μL浓度为8.22 mg/L的2-壬酮、1 g NaCl和磁力转子于20 mL顶空瓶中，加盖密封后置于磁力搅拌台上，40 ℃下平衡30 min，待平衡后将老化后的SPME萃取头插入顶空瓶，萃取头距液面1 cm，40 ℃下吸附30 min，吸附结束拔出萃取头，插入GC-MS进样口，250 ℃下热解析8 min。

1.2.4 GC-MS分析 参考Wen等[18]的方法并加以修改。樱桃香气物质检测的色谱条件：载气为高纯氦气（He>99.999%），流速1 mL/min，不分流进样。进样口温度为250 ℃，热解析时间为8 min。升温程序为：40 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min的速度升温到85 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min的速度升温到130 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min的速度升温到210 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速度升温到250 ℃，保持2 min。质谱电离方式为EI，离子能量70 eV，扫描范围为40～450 amu。

1.2.5 挥发性成分的定性、定量分析 GC-MS实验结果由NIST17数据库的相似度检索并结合参考文献中相应化合物的保留指数双重定性。将正构烷烃（C7～C40）标准品直接液体上样分析，计算保留指数，通过与NIST17数据库参考文献中相应物质的保留指数进行对比，对样品中的香气成分进行定性分析。保留指数计算公式如式（1）：

式中：t（x）、t（n）、t（n+1）分别为待测物x、具有n个、n+1个碳原子正构烷烃的保留时间。

利用内标法对香气物质进行定量，计算公式如式（2）：

式中：Cx和Mx分别为待测香气物质的浓度（mg/L）和峰面积；Cy和My分别为内标物（2-壬酮）的浓度（mg/L）和峰面积。

1.2.6 相关性分析 Pearson相关性分析常被用于分析两个变量X和Y之间的关系密切程度，可以评估二者之间的线性关系。对于变量X=[x1, x2, ···,xn]T和Y=[y1, y2, ···, yn]T，其相关系数r的取值为[−1,1]，接近0代表无相关性，接近1或−1代表强相关性。计算公式如式（3）[25]：

1.3 数据分析

采用SPSS 24.0进行数据的统计学分析；主成分分析、Pearson相关性分析及可视化由R（Rx64 3.6.3）软件分析绘制；冗余分析由Canoco 5软件分析。

2 结果与分析

2.1 GC-MS分析结果

通过GC-MS对5个不同产地‘红灯’樱桃中的香气物质进行定性、定量分析，共鉴定出32种香气成分，大多数物质在先前的文献已被报道[18−19]。其中醛类9种，萜烯类7种，酯类6种，醇类5种，酮类4种，酸类种类较少，仅有1种。每种樱桃香气物质的平均质量浓度见表2。

不同产地樱桃样品间香气物质的含量和种类均存在差异，利用R软件对香气物质在种类上的差异可视化绘制韦恩图，如图1，图中不同数字表示5个产地‘红灯’樱桃特有或共有的香气物质种类数，可得所有樱桃样品共有的香气物质为11种。山东福山‘红灯’樱桃所含香气种类最丰富，共鉴定出22种化合物，其中8种为山东‘红灯’樱桃特有的香气物质。青海和陕西‘红灯’樱桃特有的香气物质均为一种醛类和一种酯类，青海‘红灯’特有香气为月桂醛和4-己烯-1-醇乙酸酯，其中4-己烯-1-醇乙酸酯含量较高，占香气总量的18.71%。陕西‘红灯’特有香气为（E,E）-2,4-庚二烯醛和苯甲酸乙酯，但含量均较低。山西‘红灯’樱桃香气种类含量最少，仅有15种，无特有香气物质。

图2展示了不同产地樱桃香气含量的差异，5个樱桃样品中山西‘红灯’樱桃香气总量最高（65198.10 μg/L），陕西‘红灯’樱桃香气总量最低（23493.07 μg/L）。

醛类物质是樱桃香气中最主要的组分，这在先前的研究报道中已得到了证实[28]。C6醛类和芳香醛类，如己醛（青绿香气）、（E）-2-己烯醛（苹果和青绿味）、苯甲醛（苦杏仁、樱桃、坚果味）是‘红灯’樱桃的重要香气物质，在所有产地‘红灯’樱桃中均含量较高，这与Zhang等[29]先前对‘红灯’樱桃的香气研究结果一致。此外，壬醛、癸醛也是所有樱桃样品共有的醛类香气，具有一定的青绿和柑橘味[19]。山西‘红灯’樱桃含有极高的醛类香气，主要是己醛和（E）-2-己烯醛，分别占其香气总量的45.96%和47.37%，这也是导致山西‘红灯’香气含量最高的主要原因。

醇类、酮类、萜烯类和酯类香气含量远低于醛类香气，且在5个产区樱桃样品中含量差异较大。山东‘红灯’樱桃醇类香气含量最高，其次是四川‘红灯’樱桃，两产区‘红灯’樱桃醇类香气含量相差不大，值得注意的是，四川‘红灯’樱桃特有的醇类香气—“3-己烯醇”含量较高，占其醇类香气总量的60%以上，具有较强的青绿味和脂肪味。山东‘红灯’樱桃酮类香气含量仍最高，青海‘红灯’樱桃次之，而其余3个产区‘红灯’樱桃酮类香气含量较低，均不及山东和青海‘红灯’樱桃酮类香气的一半。对于萜烯类香气，山东和山西‘红灯’樱桃含量较高，陕西‘红灯’樱桃萜烯类含量最低，仅为292.04 μg/L，其余4种樱桃萜烯类香气含量达到其2.97～5.95倍。青海‘红灯’樱桃酯类香气含量最高（5874.91 μg/L），酯类香气占其香气总量的18.88%，而其余产区‘红灯’樱桃酯类香气含量相对较低，主要因为青海‘红灯’樱桃具有极高的4-己烯-1-醇乙酸酯，占其酯类香气的99.12%。就酸类香气而言，仅在山东‘红灯’樱桃中检测出一种酸类物质壬酸，且含量极低。由此可以看出，山东‘红灯’樱桃醇类、酮类、萜烯类和酸类香气含量均为最高，但因山东‘红灯’樱桃中醛类香气含量与山西‘红灯’樱桃差距较大，使得山东‘红灯’樱桃在5个产区中香气总量排名第二。

表2 樱桃果实香气物质质量浓度Table 2 Concentration of aroma compounds in cherry fruit

图1 不同产地‘红灯’樱桃样品香气种类差异图Fig.1 Different aroma types of ‘Hongdeng’ cherry from different regions

2.2 PCA分析结果

为进一步从整体上反应不同产地‘红灯’樱桃香气成分的差异，以5个产地‘红灯’樱桃样品为分析对象，采用主成分分析对32种香气成分进行分析，结果如图3（a，b）所示。从图3可以看出，前两个主成分提取了总方差的74.9%，可解释样本的大部分信息。由主成分得分图（图3a）可以看出不同产地的樱桃分布在不同象限内。山西和山东产樱桃的离散度较大，分别位于第二和第四象限内，表明二者对主成分贡献较高。四川产樱桃与青海产樱桃离散度较低，说明二者香气结构较为相似，可聚为一类，但对主成分的贡献率不高。陕西产樱桃位于第三象限内，对主成分贡献率较高，与第一主成分和第二主成分均呈负相关关系。

图2 不同产地‘红灯’樱桃香气含量差异图Fig.2 Difference of aroma content of ‘Hongdeng’cherry from different regions

进一步分析后得到PCA载荷图（图3b）。cos2值用来衡量某变量的有用程度，其值越大，该主成分贡献值越大，此时变量在相关曲线图中位于圆的边缘。同时点的大小及颜色的深浅也代表了不同变量对主成分的贡献程度。山西产樱桃与1-己醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、橙花醇等香气物质显著相关，四川、青海产樱桃与3-己烯醇、月桂醛、4-己烯-1-醇乙酸酯、脱氢二氢-β-紫罗兰酮相关性较强，而陕西产樱桃仅与（E,E）-2,4-庚二烯醛、苯甲酸乙酯显著相关。与山东产‘红灯’樱桃密切相关的香气物质较多，主要是萜烯类香气和山东产樱桃特有的酸类香气壬酸。可见不同产地的‘红灯’樱桃香气成分有很大的差异，因此下文对樱桃香气物质与一系列生态因子进行了相关性分析，以期观察生态因子对樱桃香气的影响。

图3 不同产地‘红灯’樱桃香气的主成分得分图（a）与载荷图（b）Fig.3 The PCA scores plot (a) and loading plot (b) of volatile compounds in ‘Hongdeng’ cherry in different regions

2.3 相关性分析结果

为确定产地生态因子与香气物质间的关系，对GC-MS分析结果中不同种类香气物质的含量数据和各生态因子数据进行Pearson线性相关分析，结果见表3。由表3可以发现年日照时数与酮类香气显著相关（R2=0.890）(P<0.05)，与酸类（R2=0.817）、萜烯类（R2=0.752）香气相关性较强。年积温与酯类香气达到极显著负相关（R2=−0.979）(P<0.05)。从上文图2中得知山东产樱桃含有最高的酮类、醇类、酸类、萜烯类香气，究其原因可能是因为山东地区的年日照时数最高，从而促进了香气物质的积累。青海产樱桃的酯类香气含量极高，但年积温最低，表明随着年积温的升高，樱桃酯类香气物质含量反而呈现下降趋势。醇类、醛类香气含量受产地生态因子影响较小，海拔对‘红灯’樱桃果实香气物质含量无较大影响。

表3 樱桃香气种类与产地生态因子间Pearson相关系数表Table 3 Pearson correlation coefficient between cherry aroma species and environmental ecological factors

进一步对每种香气物质相对含量与各生态因子间相关性进行分析，结果见图4，共有7种香气物质与生态因子数据达到显著（P<0.05）或极显著相关（P<0.01）。

虽然海拔与各香气物质含量相关性不强，但海拔高度直接关系到果实生长的温度、湿度和其他影响果实成熟的环境因素。由图4可知，海拔与75%香气物质均呈现负相关关系，仅与3-己烯醇、月桂醛、4-己烯-1-醇乙酸酯、橙花醇、β-大马士酮等8种香气物质呈现一定的正相关，这与Yue等[30]研究发现随着海拔的升高，葡萄果实总挥发物的浓度降低的研究结果相一致。年降水量与84.4%的香气物质呈现负相关关系，但与3-己烯醇（R2=0.977）呈现显著正相关，与β-大马士酮（R2=0.834）正相关性较强。先前的研究表明限制供给水分能够增加果实香气物质的含量[31−32]，特别是水分不足会增加脂氧合酶（LOX）和氢过氧化物裂解酶（HPL）的转录丰度，从而产生更高水平的C6醛[8]，本文显示1-己醛（R2=−0.222）、（E）-2-己烯醛（R2=−0.399）含量与降水量呈现负相关关系，研究结果支持这一结论，但并不显著。关于年降水量与果实香气间的关系，本研究与赵胜亭[13]研究发现的年降水量与苹果香气成分含量呈正相关关系的结论稍有出入，分析原因可能是不同果实香气物质的形成与代谢存在一定的差异。年积温与84.4%的香气物质呈现正相关，与5种香气物质呈现负相关关系，其中与辛醛（R2=−0.895）达到显著负相关（P<0.05），与月桂醛（R2=−0.974）、4-己烯-1-醇乙酸酯（R2=−0.974）、脱氢二氢-β-紫罗兰酮（R2=−0.979）呈现极显著负相关（P<0.01）。

图4 产地生态因子与GC-MS分析结果之间的相关性热图Fig.4 Heatmap cluster of the correlation efficients between ecological factors and volatile compounds

年日照时数与‘红灯’樱桃中75%的香气物质呈现正相关关系，特别是与香叶基丙酮和2-乙基-1-己醇两种香气呈现显著正相关（P<0.05），表明随着年日照时数的增加，这两种香气物质含量会显著提高。之前的文献报道脂肪醇类香气含量与日照时数呈正相关[33]，本研究结果中的脂肪醇除3-己烯醇外，其余脂肪醇浓度均与日照时数呈正相关，与先前的研究结果一致。可见不同产地生态因子与樱桃香气物质间具有一定的相关性。

2.4 RDA分析结果

RDA分析又叫多元直接梯度分析，可以展示环境因子、产地及香气三者之间或者两两之间的关系。观察图5得知，除海拔和年降水量外，环境因子间无明显交互作用。海拔、年降水量与各香气物质含量之间相关性较为相似，均与3-己烯醇、β-大马士酮、橙花醇等香气物质呈正相关关系，与第一象限的多种香气物质呈现负相关关系。年日照时数与各香气物质含量之间的相关性不强，而年积温与多种香气物质均呈现较为显著的负相关关系，如辛醛、月桂醛、4-己烯-1-醇乙酸酯、脱氢二氢-β-紫罗兰酮、香叶基丙酮等。

图5 ‘红灯’樱桃香气物质与产地生态因子间RDA分析Fig.5 RDA analysis between volatile compounds of‘Hongdeng’ cherry and ecological factors

观察产地、香气与生态因子三者之间的关系，可以看出四川产樱桃含有较高的3-己烯醇，海拔、年降水量与3-己烯醇呈现正相关关系，从四川的地形与环境来看，四川地区的海拔及年降水量在五个地区中均位于首位，类似的还有橙花醇和β-大马士酮。陕西产樱桃特有的（E,E）-2,4-庚二烯醛和苯甲酸乙酯可以归因于与之呈现负相关关系的年日照时数，因为陕西地区2018～2019年日照时数最低。山西产樱桃具有极高的1-己醛、（E）-2-己烯醛以及相对较高的壬醛和癸醛等醛类香气物质，主要因为山西地区常年温度较高，在五个产区中年积温最高。山东地区的樱桃酮类香气如香叶基丙酮和萜烯类香气物质如β-月桂烯、里那醇等含量相对较高，这是因为山东地区年日照时数较长，而对于青海产樱桃来说，因4-己烯-1-醇乙酸酯的含量极高导致其具有最高的酯类香气，青海地区的年积温最低，在上文中也得到了年积温与酯类香气物质呈负相关关系的结论。以上结果与上文中香气物质含量与各生态因子的Pearson相关性分析结果相一致，均表明不同产地‘红灯’樱桃香气物质之间具有一定的差异，而生态因子，特别是年积温、年日照时数和年降水量是造成这些差异的重要原因。

3 结论

本研究以我国5个地区的‘红灯’樱桃为试验对象，采用GC-MS技术对5个樱桃样品的香气特征及差异进行分析。结果表明不同产地‘红灯’樱桃香气在种类和含量上均具有一定的差异，而环境生态因子是造成这种差异的重要原因。

通过Pearson相关性分析和RDA分析探讨了樱桃香气物质与产地生态因子间的相关性，结果表明，年日照时数、年积温以及年降水量对‘红灯’樱桃香气影响较大。其中年日照时数与多数香气物质含量呈现正相关关系，特别是与酮类香气含量达到极显著正相关。年积温虽与大多数香气呈现正相关，但与酯类香气达到极显著负相关。对于年降水量来说，除醇类香气外，其余种类香气物质含量均随着年降水量的升高而呈现下降趋势。

目前关于环境因子对樱桃香气的影响少有研究，具体是哪个环境因子起主要作用，影响机制是什么尚不明确，这都需要进一步的探究。从本研究结果来看，环境对果实香气具有很大的影响，在未来樱桃的种植中，可以根据不同地区的环境气象因子，适当的改变种植环境，如年降水量较高的地区可以适当减少水分的补充，常年温度较低、日照时数较短的产区可以通过大棚保温、适当人工调节光照以提高温度和日照，从而提高樱桃的香气品质。