参地颗粒对系膜增生性肾小球肾炎大鼠单个核细胞凋亡及炎症紊乱的干预作用

茅燕萍，王恩静，金 华，魏 玲，张 磊，王亿平

(1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；2.无为县中医院，安徽 无为 238300)

最新研究显示，2003-2014年间，中国肾病疾病谱发生很大的变化，在中国原发性肾小球疾病病理类型中，系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)排名第5位。许多国内外研究也已证实细胞凋亡参与MsPGN的病程始终，高表达的凋亡细胞和细胞凋亡因子在增生性肾小球肾炎的病理解剖中被发现。少许的细胞凋亡可存在于正常肾组织内，从而维持肾脏细胞的动态平衡。当肾脏免疫炎症刺激并诱导大量淋巴细胞、单核-巨噬细胞等外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)在肾脏蓄积，各种刺激均可导致凋亡调控蛋白失衡，蓄积在肾脏的细胞发生程序性死亡，继之诱发抗原-抗体反应，产生或加重肾脏的免疫炎症紊乱，导致疾病的发生。当有严重的肾小球系膜增殖病变时，大量系膜外基质的合成以及肾间质炎症细胞因子浸润，导致肾间质纤维化的形成，进一步加重肾小球的硬化和萎缩。本研究从免疫炎症紊乱方面探讨参地颗粒对MsPGN模型大鼠的干预作用，探究参地颗粒的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 60只清洁级雄性SD大鼠，体质量200 g左右，购自上海杰思捷实验动物有限公司[生产许可证号：SCXK(沪)2013-0006]。大鼠饲养环境：室内温度(23±1)℃，湿度为40%～55%。

1.2 实验用药 参地颗粒(皖药制字 BZ20080025，批号 2016059，每袋10 g)：安徽中医药大学第一附属医院的院内复方制剂，加工生产均由医院药剂科进行。实验时用温开水溶解，按4.0 g/(kg·d)剂量(相当于成人的正常剂量30 g/d)灌胃。缬沙坦胶囊(每粒80 mg，诺华制药，国药准字 H20040217)：购自安徽中医药大学第一附属医院，实验时用温开水溶解，按10.3 mg/(kg·d)剂量(相当于成人的正常剂量80 mg/d)灌胃。模型组大鼠于同一时点给予生理盐水灌胃。

1.3 实验试剂 大鼠外周血淋巴细胞分离液(批号 LTS1083)：天津灏洋；Annexin Ⅴ-FITC/PI试剂盒(批号 A005-4)：美国Proteintech公司；大鼠MCP-1 ELISA试剂盒(批号 E-EL-R0633c)、TGF-β1 ELISA试剂盒(批号 E-EL-R0084c)：Elabscience公司；thy-1抗体(货号 MAB4110)：上海源叶生物技术有限公司。

2 方法

2.1 动物模型制备及分组 参照Geng等的方法复制抗Thy-1抗体肾炎大鼠模型。首先切除左侧肾脏，分别于术后第7、14、21、28天予以尾静脉注射抗Thy-1抗体(2.5 mg/kg)。结果共获得31只MsPGN模型大鼠，将其分为参地颗粒组、缬沙坦组各10只，模型组11只；另设10只大鼠作为正常组。

2.2 标本留取 分别于模型复制结束后0、4、8、12周收集大鼠的24 h尿液，检测24 h尿蛋白(24-hour urinary protein，24hUPr)。12周后，统一于腹主动脉采集各组大鼠的血液，脱臼处死大鼠，一部分血液采用流式细胞仪检测PBMCs凋亡率，一部分血液用于分离血清，并保存于-80 ℃冰箱中备用。采集新鲜肾组织，切取部分肾组织，于10%中性甲醛中固定；将剩余肾组织保存于EP管中，储存于-80 ℃液氮中，用于蛋白提取。

2.3 观察指标及方法 采用常规生化法检测24hUPr，采用ELISA法检测血清单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表达水平，采用流式细胞术检测PBMCs凋亡，Western blot法检测PBMCs凋亡调控蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Fas蛋白表达水平。应用HE染色、Masson染色、PAS染色技术观察肾脏病理改变。

3 结果

3.1 各组大鼠24hUPr水平比较 与正常组比较，模型组大鼠24hUPr水平升高(

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05)。与模型组比较，缬沙坦组和参地颗粒组大鼠治疗4、8、12周24hUPr水平均显著降低(

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05)。与缬沙坦组比较，参地颗粒组大鼠治疗8、12周24hUPr水平均显著降低(

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05)；且缬沙坦、参地颗粒消减尿蛋白的水平呈时间依赖性，随着治疗时间的延长，24hUPr水平均逐步降低(

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05)。见表1。

表1 各组大鼠24hUPr水平比较

3.2 各组大鼠PBMCs凋亡率和肾组织中Bcl-2、Fas蛋白表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠PBMCs凋亡率升高(

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05)；与模型组比较，缬沙坦组、参地颗粒组PBMCs凋亡率均降低(

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05)，且参地颗粒组低于缬沙坦组(

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05)。与正常组比较，模型组Bcl-2蛋白表达水平下降，Fas蛋白表达水平上升(

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05)；与模型组比较，缬沙坦组、参地颗粒组Bcl-2蛋白表达水平上升，Fas蛋白表达水平下降(

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05)，且参地颗粒组Bcl-2蛋白表达水平高于缬沙坦组(

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05)。见表2、图1。

表2 各组大鼠PBMCs凋亡率和肾组织中Bcl-2、Fas蛋白表达水平比较

图1 各组大鼠Bcl-2、Fas蛋白表达水平

3.3 各组大鼠血清MCP-1、TGF-β1水平比较 与正常组比较，模型组大鼠血清MCP-1、TGF-β1水平升高(

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05)；与模型组比较，缬沙坦组、参地颗粒组MCP-1、TGF-β1水平均降低(

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05)，且参地颗粒组血清TGF-β1水平低于缬沙坦组(

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05)。见表3。

表3 各组大鼠血清MCP-1、TGF-β1水平比较

3.4 各组大鼠肾组织病理检测结果比较 与正常组比较，模型组大鼠肾小球内可见增生的系膜细胞(每个系膜区3～5个系膜细胞)与系膜基质，肾小球体积增大，毛细血管管腔狭窄，镜下可见肾间质有淋巴细胞浸润，部分间质出现轻度纤维化。参地颗粒组与缬沙坦组大鼠肾小球内均有轻度系膜细胞增多(每个系膜区可见2～3个系膜细胞)，系膜基质并不明显，间质出现少量淋巴细胞浸润，但参地颗粒组系膜细胞增生及系膜基质增多均较缬沙坦组轻，说明参地颗粒有抑制MsPGN大鼠肾脏系膜细胞增生的作用。见图2。

图2 各组大鼠肾组织病理染色结果(10×40倍)

4 讨论

MsPGN在中国原发性肾小球疾病中发病率位列第5位，因此复制贴近临床的MsPGN动物模型对临床及科研工作者深入了解该病的发病机制、临床治疗具有重要意义。Thy-1抗原是一种高度表达于鼠类胸腺细胞表面的糖蛋白，在大鼠系膜细胞表面也发现有其表达。1980年，Ishikaki首次报道在系膜病变大鼠模型中使用了抗胸腺细胞抗体。该模型具有快速修复的特点，自然病程为35～40 d，与临床常见的不可逆性的MsPGN有很大差异，因此许多研究者开始探索接近于MsPGN的不可逆的大鼠肾炎模型。目前国内外研究已证实，单克隆抗体在纯度、特异性及可重复性方面优于多克隆抗体。1992年，Kawachi等首次报道了应用多次尾静脉注射的方法建立慢性抗Thy-1肾炎大鼠模型；1995年，Cheng等首次报道了单肾切除后给予尾静脉注射抗Thy-1抗体建立慢性不可逆性肾炎大鼠模型。这种模型比较成熟，接近于人类MsPGN，普遍地被国际上的研究采用和认可。本实验采用国产抗Thy-1抗体，给予单肾切除后，连续4次予大鼠尾静脉注射抗Thy-1抗体，建立慢性不可逆的MsPGN大鼠模型。

庞欣等发现，MsPGN大鼠肾小球细胞发生十分显著的凋亡现象，而凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax表达紊乱导致细胞凋亡增多，MsPGN组凋亡抑制因子Bcl-2下调，促凋亡因子Bax及Bax/Bcl-2显著上升。李春香等研究表明，肾脏病大鼠肾组织中Fas/FasL蛋白表达水平上升，导致肾组织中细胞的凋亡，进而引起肾小球内细胞数量的减少，加重肾组织的纤维化进展。陈浩等研究发现，MCP-1阳性表达的相对面积随系膜增生严重程度而增加，同时也观察到MCP-1在炎症细胞浸润较重的部位呈强表达。Yu等研究发现，抑制肾组织中趋化因子的表达，可以改善肾小球系膜细胞增殖，改善细胞外基质的积累以及抗Thy-1大鼠尿蛋白的分泌。徐文燕等研究发现，MsPGN大鼠肾组织存在TGF-β1和p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路的活化，该信号通路是机体重要的炎症反应通路之一，可以加速炎症反应。

参地颗粒组方源自安徽省名中医王亿平创立的人参汤，人参汤可有效降低脾肾亏虚型慢性肾炎患者的尿蛋白水平。参地颗粒是由人参汤核心组方(红参、熟地黄、茯苓、五味子、桑螵蛸、鸡内金、川芎)转化而成，临床主要应用于慢性肾炎脾肾亏虚证的治疗。临床研究表明，参地颗粒能降低脾肾亏虚证慢性肾炎患者中医证候积分，改善临床症状，降低24hUPr和尿红细胞计数。相关机制研究发现，参地颗粒对系膜增生性肾小球肾炎大鼠CTLA-4/B7-1介导的免疫炎症紊乱、大鼠T细胞亚群平衡、NF-κB信号通路和肾脏基质金属蛋白酶-9和金属蛋白酶组织抑制剂-1的表达均有不同程度的干预作用。本次研究发现，参地颗粒具有减轻肾脏炎症反应，消减尿蛋白、改善MsPGN大鼠的肾脏病理损害的作用，其机制可能是通过调节凋亡调控蛋白Bcl-2、Fas蛋白表达水平，降低MsPGN大鼠PBMCs凋亡率，下调血清炎症递质MCP-1、TGF-β1表达水平实现的。