USP15及α-SMA在青光眼滤过术后瘢痕组织中表达的实验研究

全夫，刘艳，余玲

(1.西南医科大学附属医院眼科，四川 泸州 646000； 2.西南医科大学，四川 泸州 646000)

青光眼是一种病理性眼内压升高导致特征性视神经损害和视野缺损的疾病，其发病率在全球范围内呈持续升高趋势[1]。目前，通过在球结膜下建立功能性滤过通道来控制眼压的青光眼滤过手术(glaucoma filtration surgery，GFS)仍是治疗青光眼的有效方法，但失败率约为20%，导致手术失败的主要原因是在手术区域内成纤维细胞的增殖致滤过通道的瘢痕形成，滤过通道功能减弱，从而导致眼压再次升高[2-4]。

泛素特异性蛋白酶15(ubiquitin-specific proteases 15,USP15)的基因位于染色体带12q14处，由952个氨基酸组成，分子量为109 200，属于泛素特异性加工酶家族的一员[5-6]。研究表明，对小鼠进行USP15基因敲除，小鼠表现为切口愈合延迟，瘢痕化进展减慢[7]。在瘢痕纤维化过程中，USP15可维持转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)途径的活性[8]，USP15可被介导与Smad泛素化因子2形成复合物，作用于TGF-β受体(transforming growth factor-β receptor，Tβ-R)并去泛素化Tβ-RⅠ，稳定Tβ-RⅠ，从而增强TGF-β信号通路转导，促进纤维化过程[9]。王洋等[10]发现USP15与TGF-β信号通路作用相关，而TGF-β信号通路已被证明与瘢痕的形成密切相关。目前，USP15在瘢痕组织中表达的研究较少见。

从肉芽肿到瘢痕增生的形成过程中，肌成纤维细胞是组织瘢痕化的关键细胞，而肌成纤维细胞的主要组成成分为α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，即α-SMA表达水平越高，组织瘢痕化程度越严重[11-12]。本研究旨在通过检测GFS术后瘢痕组织中USP15和α-SMA的表达并分析两者的关系，为研究如何抑制GFS术后滤过通道的瘢痕化提供新思路。

1 材料与方法

1.1实验动物 20只健康成年新西兰大白兔，清洁级别，不分雌雄，体重1.65～1.75 kg，由西南医科大学动物实验中心提供[使用许可证：SYXK(川)2018-065]，室温约26 ℃，实验前将净水和人工饲料混合并饲养1周。实验遵守视觉与眼科学研究协会有关动物在眼科及视力方面研究的规定。

1.2主要仪器及试剂 光学显微镜(日本Olympus公司)；眼科显微手术器械(中国苏州医疗器械有限公司)；Tono-pen眼压计(美国Reichert公司)；USP15抗体(英国Abcam公司)；α-SMA抗体(英国Abcam公司)；免疫组织化学试剂盒(江苏江莱生物科技有限公司)。

1.3方法 采用自身双眼对照设计研究，以右眼为实验组(20只)，建立GFS的动物模型，左眼作为正常对照组(10只)。随机将实验组分为术后14 d组(10只)、术后28 d组(10只)。对家兔行苯巴比妥钠1 mL/kg耳缘静脉注射麻醉，术前局部用盐酸丙卡因滴眼液表面麻醉。右眼常规消毒、铺巾，沿角膜缘用钝头的Westcott剪刀切开并直接切开结膜和腱膜。用30°弯刀制造3 mm×4 mm的巩膜瓣(1/2巩膜厚度)，无齿镊提起半厚的巩膜瓣，直到观察到小梁，眼科剪剪除Schlemm管和小梁网在内的矩形角巩膜以及部分外周虹膜根部，放下巩膜瓣将巩膜瓣两端各缝1针，球结膜用10-0尼龙针缝合2针。术后使用左氧氟沙星滴眼液预防感染。同一人使用Tono-pen眼压计于同一日上午9：00～11：00测量家兔眼压，同眼连续测量3次，取平均值。术前测量实验组和正常对照组眼压，术后测量14 d组和28 d组眼压。实验组分别在术后14 d和28 d观察角膜、前房、滤过泡及瘢痕组织的外观，并在术后14 d及术后28 d瘢痕组织上分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)、Masson和免疫组织化学染色，分析实验组瘢痕组织和正常对照组结膜组织中USP15和α-SMA的表达。

1.4结果判定标准 采用Sinicrope等[13]的标准对每个视野的阳性细胞数和染色深度进行评分，总分为染色强度得分和阳性染色细胞百分比得分的乘积。染色强度确定标准：无色或浅黄色与背景一致为0分；浅棕黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。其中0分表示阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为阳性，9～12分为强阳性。阳性染色细胞的百分比标准：每个标本随机选择3个视野，每个视野计数100个细胞，并计算3个视野中阳性细胞的平均数量，其中<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。

2 结 果

2.1造模结果

2.1.1眼压结果 实验组基线眼压为(15.00±0.67) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，正常对照组为(14.90±0.74) mmHg，两组比较差异无统计学意义(t=0.857，P=0.379)。正常对照组、术后14 d组、术后28 d组眼压比较差异有统计学意义(P<0.01)，术后14 d组眼压低于正常对照组(P<0.05)，术后28 d组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，术后28 d组高于术后14 d组(P<0.05)，见表1。

表1 正常对照组与实验组眼压比较

2.1.2HE染色结果 正常结膜组织HE染色示结膜组织形态完整，组织排列较整齐；术后14 d结膜组织HE染色示结膜下炎症细胞浸润、纤维组织形成，组织排列紊乱，滤过道受到牵拉、变窄；术后28 d结膜组织HE染色示结膜下大量纤维组织收缩，滤过道消失。见图1。

1a：正常结膜组织；1b：术后14 d结膜组织；1c：术后28 d结膜组织；箭头表示该处染色的变化

2.1.3Masson染色结果 正常结膜组织Masson染色示结膜下组织极少量胶原沉积；术后14 d结膜组织Masson染色示结膜下及滤过道少量胶原沉积；术后28 d结膜组织Masson染色示结膜下及滤过道大量胶原沉积。见图2。

2a：正常结膜组织；2b：术后14 d结膜组织；2c：术后28 d结膜组织；箭头表示该处染色的变化

2.2瘢痕组织USP15及α-SMA的表达水平

2.2.1USP15的表达 正常结膜组织中，USP15为阴性或弱阳性表达，极少量表达于结膜上皮层和基质层胞质及胞核；术后14 d瘢痕组织中，USP15少量表达于结膜上皮层及基质层成纤维细胞质及胞核；术后28 d瘢痕组织中，USP15大量表达于结膜上皮全层及成纤维细胞质及胞核，见图3。各组USP15表达比较差异有统计学意义(P<0.01)，术后14 d组、术后28 d组高于正常对照组，术后28 d组高于术后14 d组(P<0.05)，见表2。

表2 正常对照组与实验组瘢痕组织中USP15表达水平的比较

3a：正常结膜组织中USP15弱阳性表达；3b：术后14 d结膜瘢痕组织中USP15阳性表达；3c：术后28 d结膜瘢痕组织中USP15强阳性表达；箭头表示该处USP15阳性表达

2.2.2α-SMA的表达 各组α-SMA表达比较差异有统计学意义(P<0.01)，术后14 d组、术后28 d组高于正常对照组，术后28 d组高于术后14 d组(P<0.05)，见表3。正常结膜组织中，α-SMA为阴性或弱阳性表达，极少量表达于结膜上皮层和基质层胞质及胞核；术后14 d结膜组织中，α-SMA少量表达于结膜上皮层及基质层成纤维细胞质及胞核；术后28 d结膜组织中，α-SMA大量表达于结膜上皮全层及成纤维细胞质及胞核，见图4。

表3 正常对照组与实验组瘢痕组织α-SMA表达水平比较

4a：正常结膜组织中α-SMA弱阳性表达；4b：术后14 d结膜瘢痕组织中α-SMA阳性表达；4c：术后28 d结膜瘢痕组织中α-SMA强阳性表达；箭头表示该处α-SMA阳性表达

2.3瘢痕组织中USP15与α-SMA表达的相关性 Pearson相关分析结果显示，正常结膜组织中USP15与α-SMA表达无相关性(r=0.063，P=0.297)；术后14 d瘢痕组织中USP15与α-SMA表达呈正相关(r=0.865，P<0.001)；术后28 d瘢痕组织中USP15与α-SMA表达呈正相关(r=0.976，P<0.001)。

3 讨 论

青光眼是一种致盲性眼病，可对视神经及视野造成不可逆的损害。GFS已成为青光眼治疗的标准手术方法，但术后滤过道的瘢痕形成是手术失败的最常见原因[14]。目前关于GFS术后瘢痕形成机制的研究较多。USP15广泛分布于人体的各个组织器官，其作为去泛素化酶的成员，可参与细胞内蛋白质的去除过程，同时在调节DNA转录与修复、细胞生长与凋亡、免疫应答中起关键作用。有研究表明，TGF-β信号通路可通过调节磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号而上调USP15信号，从而稳定p53并抑制肿瘤恶化[15-16]。故肿瘤等疾病的发生发展可能是由于USP15的高表达引起TGF-β信号转导过程失调所致。以上研究结果显示，USP15与TGF-β信号通路可能具有相互调节的作用。

在增生性瘢痕形成过程中，TGF-β信号通路主要通过TGF-β/Smad发挥生物学调控作用，而Tβ-R又是TGF-β/Smad信号转导通路的关键受体，其异常表达与瘢痕的形成密切相关。TGF-β通过膜受体Tβ-RⅠ和Tβ-RⅡ活化前体物质后与Tβ-RⅡ结合形成Tβ-RⅡ复合物，并迅速引起Tβ-RⅠ磷酸化，激活靶基因的转录[17]。Smad7蛋白可通过与Smad3竞争Tβ-RⅠ而阻止受体介导的Smad3活化，阻断TGF-β信号转导，从而负反馈调节TGF-β/Smad信号通路[18]。研究显示，Smad7还可介导USP15去泛素化并稳定Tβ-RⅠ增强TGF-β信号通路转导过程，该过程由Smad7介导USP15与Smad泛素化调节因子2形成复合体，使USP15作用于Tβ-RⅠ并使其去泛素化，从而在稳定Tβ-RⅠ的同时增强TGF-β信号转导[9，19]。也有研究发现，USP15可被肿瘤坏死因子受体相关因子4通过拮抗Smad泛素化调节因子2促进其与Tβ-R作用，使Tβ-RⅠ去泛素化并稳定，从而增强 TGF-β信号转导[20]。

本研究对家兔进行术前、术后眼压测量，结果显示术后14 d、28 d眼压逐渐升高，组织瘢痕增生逐渐增加，与既往研究结果一致[21]，说明兔眼GFS术后模型成功建立。同时，本研究结果还显示，USP15在GFS术后14 d、28 d结膜瘢痕组织中异常高表达，并且与α-SMA表达呈正相关，验证了USP15在瘢痕组织中的高表达同样可能使TGF-β信号转导过程失调，促进组织瘢痕增生[15-16]。而USP15是否协同Smad7及其他相关因子调节TGF-β信号通路在瘢痕组织形成过程中的作用可能是下一步研究USP15调控TGF-β信号通路具体机制的方向。

综上所述，USP15在瘢痕组织中异常高表达，且与α-SMA相关，提示USP15可能在GFS术后的滤过道瘢痕形成过程中发挥作用，可为GFS术后瘢痕的发病机制和治疗提供新的研究目标和思路。