流式细胞术在肿瘤诊断中的应用

方汝花，朱 静

（1.中国科学院肿瘤与基础医学研究所；2.中国科学院大学附属肿瘤医院检验科；3.浙江省肿瘤医院检验科，浙江 杭州 310022）

肿瘤作为威胁人类健康且发生率逐年提升的一类疾病，即使在很多医学难题得以解决的今天，肿瘤的治疗仍然难有突破性进展[1]，其根本原因在于对肿瘤的相关机制研究不够深入或者说难以深入，因此，临床上对于肿瘤以早发现早控制为最优治疗方案。流式细胞术（flow cytometry, FCM）[2]作为综合了细胞生物学、物理学等多种原理和技术的综合性检测技术，自发明以来经历了半个世纪的发展并日臻完善，其检测原理是在细胞快速流动的条件下对细胞粒子或细胞进行检测并进行荧光标记，从而进行细胞检测和分选，具有检测准确、迅速、敏感性高的特点。目前，FCM的临床应用包括微生物检测、免疫疾病诊断、血液疾病监测和肿瘤诊断等方面，本文就FCM在肿瘤诊断方面的新进展进行综述，以期为肿瘤的早期发现和治疗，FCM的应用提供借鉴。

1 细胞生物学标志诊断

FCM最早用于肿瘤诊断是通过检测细胞的DNA含量，分析肿瘤细胞DNA倍体实现的，DNA倍体分析是指一种（一组）染色体变异情况的分析，在正常的非增生细胞内染色体的形状和数目是稳定的，呈二倍数，而肿瘤细胞则会呈现异常数目。因此这种生物学标志可以判断肿瘤组织细胞的发展趋势和病变程度，同时也可以检测药物对肿瘤细胞的影响，这也是临床上FCM结论经过验证、应用价值最大的研究成果[3]。FCM诊断癌前病变的样本多样，包括实体瘤或穿刺标本、组织液、体液、灌洗液脱落细胞等，特别是在淋巴瘤的诊断上，FCM在病理形态学改变之前就能提供DNA倍体改变的诊断信息，且DNA倍体诊断比形态学更具有说服力，即使形态学表现为良性，非整倍体的出现也提示肿瘤恶变的可能。FCM检测实体瘤样本DNA的流程为：(1)分散解聚实体瘤组织样本成为单细胞悬液。(2)荧光染料PI与DNA、RNA结合。(3)RNA抑制剂消化染色后的RNA。(4)检测PI染色后的DNA荧光强度。陈秋勤等[4]对168 例尿路上皮肿瘤疑似患者的尿脱落细胞分别进行液基薄层细胞学检测（TCT）联合DNA倍体分析、TCT和传统涂片法进行诊断，并以敏感度和特异性作为检测指标进行评价，结果显示三种检测方法的特异性差异无统计学意义，但联合了FCM DNA倍体分析的检测方法的灵敏度（79.0%）要高于其他两个（69.4%、48.4%）。同样的，付爱君[5]在研究FCM DNA定量分析对宫颈癌恶性肿瘤的实验中也得到了类似的结论，即TCT联合FCM DNA定量分析可以提高诊断结果的敏感度（90.9%）、高级别病变检出率。胡艳芬等[6]为了从统计学角度验证FCM通过检测DNA倍体数来诊断肿瘤的效果，采用Meta-Di20Sc201.4对相关文献数据进行统计分析，结果显示纳入研究的1 340 例研究对象（824 例良性患者对照，516 例恶性肿瘤患者）采用FCM诊断肿瘤具有较高的准确度，可作为临床肿瘤鉴别的重要手段。

2 细胞动力学标志诊断

关于肿瘤细胞诊断的动力学标志包括细胞周期、增殖、分化和凋亡水平。研究新颖药物作用于肿瘤的机制研究也是着重从动力学标志入手。

细胞周期异常是肿瘤细胞诊断的中心标志之一，细胞周期的调控严格上来讲包括驱动机制和监控机制，正常调控机制下的细胞周期分为G1、S、G2和M期[7]。但细胞周期调控机制的失控能够发生在细胞DNA修复、死亡等任何一个环节，进而引起细胞基因组的紊乱，导致细胞进入失控性增长状态也就是肿瘤细胞。FCM可以通过检测肿瘤细胞在周期各期的细胞数目变化，进而可以分析出肿瘤细胞的病变情况。江育莹等[8]为探究化合物ZWF对肺癌细胞A549的作用机制，分别研究了化合物作用于肺癌细胞后细胞的周期、迁移和凋亡情况，其中FCM观察周期的影响实验结果显示G1期细胞的比例增高且大于对照组，说明化合物ZWF将肺癌细胞的周期阻滞在G1期，也从侧面反映出FCM检测周期在肿瘤鉴别中辅助作用的有效性。

细胞增殖和分化异常是肿瘤细胞诊断的重要标志，通过FCM可以观察到细胞的单位数和处于细胞周期各段的细胞数目，进而判断细胞数量和分化情况，可作为肿瘤诊断的辅助参数，也是探究药物作用机制的重要指标。韩杰等[9]研究了不同浓度的粉防己碱对白血病KG-1细胞的增殖、分化和凋亡情况，FCM检测KG-1细胞分化抗原CD14、CD11b的表达，有两个浓度的粉防己碱组的分化抗原表达量要高于不给药的空白组，说明适当浓度的粉防己碱具有诱导肿瘤细胞分化的作用。

细胞凋亡是由多基因调控的基本生物学过程，肿瘤的发生会使细胞凋亡出现紊乱，因此通过检测细胞的凋亡情况可以作为肿瘤诊断的一个辅助参数。FCM可以通过单克隆抗体检测细胞膜表面凋亡基因调控的相关蛋白的特异性表达情况来确定细胞凋亡是否紊乱，以此作为诊断指标。另外，细胞凋亡也是判断药物作用于肿瘤细胞是否有效的一个重要判断依据，如潘越等[10]开展了华蟾毒它灵对肝癌SNU-739细胞作用机制研究，细胞凋亡方面，通过FCM结合TUNEL染色确定了该药物可诱导SNU-739细胞的凋亡。

3 免疫学标志诊断

FCM检测肿瘤细胞免疫学标志的应用原理是抗体抗原反应及其后续的激光激发荧光素显色，从而能够分析出细胞分类和各亚群、淋巴细胞膜表面分化抗原（CD），并通过淋巴细胞各亚群的百分比来评价免疫状态。目前CD抗体、非CD抗体、CD亚类抗体已发展到上千种，因此临床中筛选到了一些具有代表型的标志物进行肿瘤诊断[11]。FCM免疫学诊断最开始应用于急性白血病（中华医学会检验医学分会发布的FCM诊断急性白血病的特异性标志抗体组合如表1所示），现又拓展到成熟淋巴细胞肿瘤（FCM诊断成熟淋巴细胞瘤的特异性标志抗体如表2所示）等的诊断。《淋巴瘤病理诊断规范》项目组也提出FCM诊断是淋巴组织肿瘤诊断的必要程序[12]。冯睿婷等[13]以FCM检测52 例鼻咽癌患者和50 名健康者的外周血淋巴细胞亚群CD3-CD(16＋＋56＋)、CD8＋、CD4＋、CD3＋水平和活化T淋巴细胞CD8＋/HLA-DR、CD3＋/HLA-DR水平，实验结果提示实验组的免疫学参数异常，免疫功能低于健康对照组，因此FCM检测活化T淋巴细胞和外周血细胞亚群能够作为诊断肿瘤及其免疫活化状态的参数。

4 基因标志诊断

现代分子生物学相关研究证实肿瘤的发生是由多基因调控、多步骤变化导致的细胞失控性生长的复杂过程，导致肿瘤发生的功能基因调控改变一般被分为三种类型[14-15]：(1)原癌基因的激活：原癌基因如cerbB-2、myc基因簇等，在正常情况下具有正常的生理功能，致使细胞恶性转化从而有致癌能力则是由于原癌基因的异常激活或突变。(2)肿瘤转移与转移抑制基因调节：该类基因如CD44V6、Nm23等通过调控肿瘤细胞免疫原性及信号转导通路来抑制肿瘤细胞趋化、迁移和侵袭。(3)抑癌基因的失活：抑癌基因如p16、RB等有着负调节细胞增殖过程的作用，抑癌基因突变或缺失导致的失活会失去其对细胞增殖的调控，从而导致细胞的无限增殖形成肿瘤。因此，从分子水平研究细胞中相关肿瘤基因的表达对于肿瘤的发生诊断是一种更为精准的方法，而不断发展完善的FCM为检测肿瘤基因及其表达蛋白提供了一种很好的方法。例如ARHI作为母源性印记基因，其编码蛋白在人体多个组织中均有不同的表达，而在一些肿瘤细胞如肝癌、乳腺癌等细胞中却表达下调或缺失，说明该基因与肿瘤的发生有一定相关性，为证实这一结论，叶凯山[16]分别测定了骨肉瘤细胞U20S、MG-63、SAOS-2及正常成骨细胞hFOB1.19中ARHI mRNA及ARHI蛋白的表达，结果显示在骨肉瘤细胞中ARHI mRNA及ARHI蛋白的表达均比正常细胞中明显下降。未来随着细胞通路研究的深入，FCM也有望在单细胞水平上直接检测细胞内肿瘤调控基因及其蛋白的表达水平。

5 肿瘤干细胞（CSCs）诊断

CSCs被认为是区别于具有组织来源特性的普通肿瘤细胞外的少量细胞，具有无限自我更新并多向分化的潜能，可以称之为肿瘤母细胞，与肿瘤的发生、转移、复发和多重耐药性的产生具有直接或间接的关系[17]，因此针对CSCs的研究将成为肿瘤治疗的新突破点。由于CSCs的含量仅有0.01%～0.02%，因此分选鉴定CSCs成为后续研究的关键一步。FCM可以通过细胞表面抗原标记物、测定乙醛脱氢酶-1活性和侧群细胞分析等方法分离鉴定出CSCs[18]。Bao等[19]的研究中表明通过FCM检测CD133＋标记物可以作为鉴别胶质瘤细胞的参考；不同的CSCs标记物各有不同，有些干细胞需要多种标记物联合才能进行诊断，如Sun等[20]对CSCs的研究中指出CD133＋要联合CD24＋、CD44＋等标记物才能鉴别肝癌干细胞。目前用于FCM检测的CSCs特异性标志物的研究已涉及多种肿瘤类型，总结如表3所示。

表3 CSCs特异性标志物（FCM检测）

6 循环肿瘤细胞（CTCs）诊断

CTCs是外周血液中肿瘤细胞的统称[21]，一般是指从肿瘤原发灶或转移灶因自发或诊疗手术等因素影响而脱落并进入外周血循环的肿瘤细胞，其中少数不能被吞噬或凋亡的CTCs会通过血液循环到达其它组织和器官，并发展成新的转移灶，成为肿瘤转移发生的重要途经。有研究[22]表明CTCs出现在可见实体肿瘤之前，因此对CTCs数量和表型的检测可以有效诊断肿瘤的发生和分型。同时，由于CTCs出现在外周血液中，因此可以进行液体活检，这种肿瘤诊断方式具有取样方便、成本低、无放射性影响和分子信息全面的优势，也成为近年来肿瘤无创诊断的研究热点之一。由于CTCs的数量稀少，在有106个白细胞和109个红细胞的1 mL外周血液中仅有个位数，因此应用传统FCM要先对CTCs进行富集再进行检测。李军等[23]首先采用免疫磁珠负性筛选策略对20 例食管鳞癌患者外周血的CTCs进行富集，而后采用FCM结合密度梯度离心法进行联合检测，CTCs的检出阳性率可达75%。为了提高FCM检测CTCs的效率和敏感度，不少研究针对FCM的提升进行展开，如FAST流式细胞仪不需要对细胞进行富集就可以检测到稀少的CTCs；光流控FCM[24]可以连续自动地实现CTCs的分离、单细胞参数分析和分型计数。

7 总结与展望

FCM自运用以来最早应用于肿瘤学，有研究者使用FCM诊断早期癌症，结果证明其准确率高达90%[25]，充分说明了FCM在肿瘤诊断方面的广阔前景，并且上述所提及FCM在细胞生物学、动力学、免疫学、基因表达、干细胞和CTCs等方面的分析检测仍在深入研究。新时代分子生物学大发展，FCM在众多分子诊断新技术不断涌出的背景下凭借其独特的检测原理和不断完善的检测技术仍发挥着不可替代的作用，在未来也将与其它更广泛的学科相结合，为临床研究提供更完美的检测技术。