石林县三七仿生种植对根际土壤微生物多样性的影响*

2021-06-11张义杰靳百慧全怡吉王文鹏何霞红

云南农业大学学报(自然科学) 2021年3期

张义杰，张帅，粟珊，靳百慧，全怡吉，王文鹏，杨宽，何霞红,2

(1.云南农业大学植物保护学院，云南昆明 650201；2.西南林业大学，云南昆明 650224)

三七[Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen]是中国大宗名贵中药材之一，占云南省药材产值的一半以上，是实现中药材原料生产现代化的标志性作物之一，但是三七连作障碍严重，严重制约了三七产业的健康发展[1-2]，而连作障碍的机理十分复杂，包括土传病害、自毒作用、土壤养分失衡和微生物的失衡等因素[3-4]。研究表明：连作障碍是现代农作物大水大肥的高产栽培模式应用于中药材三七种植的必然结果，高产栽培模式造成的不宜生长环境(如土壤板结、土壤富营养化、土壤水分过量和温光控制不合理等)均会加重连作障碍的形成[5-7]。改变传统三七种植模式，寻找适宜三七生长的健康栽培模式是解决三七连作障碍的必然选择。

仿生种植是指在植物的结构和功能的基础上，结合工程技术，实现对植物生长环境的模拟、创造，最终达到种植与野生的指标相一致[8]。而三七仿生种植模式，是在三七连作障碍机理研究的基础上，利用现代农业技术从土壤改良、养分管理、生长环境控制、病虫害控制和土壤修复等方面进行改良，从而形成区别于传统种植的新型种植模式[9-11]。通过多年来的试验和农业生产应用，仿生种植现已在克服三七连作障碍和确保药材道地性方面取得了重要突破。

在仿生种植过程中，包括土壤的耕作方式、农药使用及施肥方式[12-15]和土壤类型、温度、水分、植被等自然环境的变化，均会影响土壤微生物的多样性。这些改变的土壤微生物，特别是根际土壤微生物，作为植物与土壤之间关键的联系媒介，对植物的生长发育起到重要作用：其一促进植物生长；其二促进腐殖酸的形成，改善土壤结构；其三与病原菌竞争营养和空间，减少病原菌侵害，对病害的防治具有重要的作用[16-19]。

越来越多的研究表明：通过调整根际微生物的群落组成结构，可以从根源上抑制病原菌的生长，从而解决植物的连作问题。因此，我们以仿生种植的三七根际微生物为研究对象，以传统种植三七为对照，探究仿生种植对三七根际土壤微生物多样性的影响，以期从土壤微生物多样性的角度解析仿生种植克服三七连作障碍的机理。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

试验地点分别位于石林县云南三七科技公司的三七仿生种植基地(海拔1 709 m，N24°46′38.8″，E103°17′18.8″)和石林县天士力公司的三七传统种植基地(海拔2 030 m，N24°39′5.6″，E103°19′18.1″)。

三七仿生种植基地面积为13.34 hm2，基地的土壤已经连茬种植过三七(表1)。经过95 ℃，30 min 的高温蒸汽消毒再种植一年七、二年七。三年七是上一年度种植的继续生长的二年七，三年七的土壤不进行高温蒸汽消毒处理。仿生种植模式中，每667 m2一次性施用1 t 有机肥，并减少氮肥使用，全年每667 m2施用复合肥10 kg。生产中不施用化学农药防治病虫害。

表1 土壤样品及相关信息Tab.1 The list of different soil information

传统种植基地种植面积为13.34 hm2，基地的土壤利用生石灰进行土壤消毒后种植二年七，第2 年时该土壤不进行生石灰消毒处理，二年七继续生长成为三年七。传统种植模式中，按传统生产管理进行，不施用有机肥，全年每667 m2施用复合肥25 kg，按传统管理喷施化学农药进行病虫害防治。

仿生种植和传统种植的种植方法与种植规格相同。每年12 月种植，一年七种植的株行距为5 cm×5 cm，二年七种植的株行距为10 cm×15 cm。在仿生种植模式中，设置土壤经高温消毒种植一年七和二年七各30 m2，并设置土壤经高温消毒未种植三七的对照6 m2。三年七选取上一年度的二年七30 m2进行观察和取样。传统种植模式，设置土壤经生石灰处理后种植一年七和二年七各30 m2，并设置土壤经生石灰处理未种植三七的对照30 m2。三年七选取上一年度的二年七30 m2进行观察和取样，每个处理各设4 个重复。

在三七收获的季节11 月中旬，采用5 点取样法进行取样，每点随机挖取三七30 株，刷取三七根系表面的土壤混匀[20]，置于冰盒尽快带回实验室放在4 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 根际土壤细菌的分离与鉴定

取10 g 根际土壤，置于装有90 mL 无菌水的三角瓶中，转速150 r/min 摇床30 min，使细菌充分悬浮于水溶液中，用移液枪吸取上清液1 mL 转移至装有9 mL 无菌水的试管里，按照稀释分离程序配制不同密度梯度(10-4、10-5和10-6)的菌液；分别取100 μL 涂布在NA 培养基上，每个梯度做3 个重复，置于28 ℃培养箱培养24～48 h。观察菌落形态和颜色特征，将不同的菌落分别挑至NA 培养基上编号，逐步分离纯化，最后将得到的单菌株进行保存。通过扩增16S rDNA序列对三七根际土壤细菌进行分子鉴定。

1.2.2 根际土壤真菌的分离与鉴定

取10 g 根际土壤，置于装有90 mL 无菌水的三角瓶中，转速150 r/min 摇床30 min，使真菌充分悬浮于水溶液中，用移液枪吸取上清液1 mL 转移至装有9 mL 无菌水的试管里，按照稀释分离程序配制成不同密度梯度(10-1、10-2和10-3)的菌液；分别取100 μL 涂布在PDA 培养基上，每个梯度做3 个重复，置于25 ℃培养箱培养5～7 d。观察菌落特征，将不同的菌落分别挑至PDA 培养基上编号，逐步分离纯化直至得到纯化的单菌落，将得到的单菌株进行保存。将菌接种到PDA 培养基上，培养5～7 d，视菌丝生长速度不同而定。无菌环境下刮取菌丝于无菌研钵内充分研磨，采用CTAB 法提取待测菌株的DNA，通过扩增ITS rDNA 序列对三七根际土壤真菌进行分子鉴定。

1.3 数据统计与分析

所有数据均采用软件SPSS 17.0 (SPSS Inc.，Chicago，IL) 和Excel 进行处理和统计分析。不同处理之间的方差分析用单因素ANOVA 进行。根际土壤微生物的多样性分析中各参数计算公式和含义如下：

相对频率(relative frequency，RF)：是指样品中分离到的某种土壤细菌或者真菌的菌株数占分离到的各总菌株数的百分数。

多样性指数(Shannon diversity index，H′)：Pi指某种土壤细菌或者真菌的菌株数占分离到的各总菌株数的百分数。

相似性系数(Cs)：根据Sorenson 系数公式计算，Cs=2j/(a+b)，式中，j是2 种样本共同具有的土壤细菌或者真菌种类数，a是一种样本内细菌或者真菌种类数，b是另一种样本土壤细菌或者真菌种类数，相似性系数可以比较2 种样本之间土壤细菌或者真菌种类组成的相似程度。

2 结果与分析

2.1 仿生种植对三七根际土壤微生物数量的影响

2.1.1 仿生种植对三七根际土壤细菌数量的影响

通过传统微生物分离方法对分离到的土壤细菌数量进行分析，结果 (图1)表明：仿生种植模式下，一年七、二年七和三年七的根际土壤细菌数量分别为17.76×105、20.76×105和16.56×105CFU/g，分别比CK (9.36×105CFU/g)高出90%、122%和77%。传统种植模式下，二年七和三年七的根际土壤细菌数量依次为5.58×105和5.22×105CFU/g，与CK 存在显著差异，分别较CK低37% 和41%。由此可知，相比传统种植模式，仿生种植有利于三七根际土壤细菌数量的生长，且保持较高水平。

2.1.2 仿生种植对三七根际土壤真菌数量的影响

由图1 所示：2 种种植模式的三七根际土壤真菌的数量，随种植时间的延长，都呈递增趋势。但是从二年七到三年七的过程中，仿生种植和传统种植的真菌增长率分别为19.16%和42.59%。相比传统种植模式，仿生种植模式虽然不能降低三七根际土壤中真菌的数量，但是可以降低真菌的增长速率。

图1 2 种种植模式下三七根际细菌和真菌的数量分析Fig.1 The quantitative analysis of rhizosphere bacteria and fungi in two planting patterns

深入分析土壤中真菌/细菌的比值可以发现：种植三七后，在仿生种植模式下，真菌/细菌的比值介于3.42～6.72 之间，而传统种植的真菌/细菌的比值介于10.1～14.56。说明仿生种植可以有效降低土壤中真菌/细菌的比值。

2.2 仿生种植三七根际土壤生物的群落组成分析

2.2.1 三七根际土壤细菌的相对频率

如表2 所示：仿生种植一年七、二年七和三年七 (SB1、SB2 和SB3)的细菌种类分别隶属于4、3 和5 个属，且优势菌属都为假单胞菌属，相对频率依次为58%、73%和89%，均显著高于对照，说明仿生种植有利于三七根际土壤假单胞菌的生长。传统种植处理中，对照(STCK)和2 个处理(ST2 和ST3) 的细菌种类分别隶属于2、3 和3 个属，优势菌属为假单胞菌属，相对频率依次为62%、63%和65%。由此可知：相比传统种植，仿生种植模式下的三七根际土壤细菌的种类更丰富，有助于提高细菌群落结构的复杂性。

表2 2 种种植模式下三七根际土壤细菌的相对频率Tab.2 The relative frequency of bacteria in P.notoginseng rhizosphere soils of bionic and traditional patterns %

2.2.2 三七根际土壤真菌的相对频率

如表3 所示：仿生种植模式中，一年七、二年七和三年七(SB1、SB2 和SB3)的真菌种类分别隶属于7、6 和5 个属，优势菌属依次为被孢菌属、青霉菌属和被孢菌属，相对频率依次为38%、50%和41%。在一年七、二年七和三年七的根际土壤中，发现镰刀菌的分离频率分别为2%、6% 和5%。在传统种植处理中，对照、二年七和三年七(STCK、ST2 和ST3) 真菌的种类依次隶属于5、3 和5 个属，优势菌属分别为青霉菌属、被孢菌属和青霉菌属，相对频率依次为39%、79%和40%，种植三七后，二年七和三年七根际土壤镰刀菌属的相对频率分别为9%和18%，同时其相对频率高于同一年份仿生种植三七根际土壤镰刀菌属的相对频率。由此可知：仿生种植的土壤真菌种类丰富，有利于土壤中真菌群落的生长，抑制土传病害病原菌镰刀菌的生长。

表3 2 种种植模式下三七根际土壤真菌的相对频率Tab.3 The relative frequency of fungi in P.notoginseng rhizosphere soils of bionic and traditional patterns %

2.2.3 三七根际土壤细菌群落相似性

由表4 可知：仿生种植各处理之间的相似性系数都≥0.92，说明在三七连作过程中，细菌群落相似性波动不大。而传统种植各处理之间的相似性系数为0.88，存在一定的波动。

表4 2 种种植模式下三七根际土壤细菌的相似性系数(Cs)Tab.4 The bacteria sorenson coefficient (Cs) in P.notoginseng rhizosphere soils of bionic and traditional patterns

2.2.4 三七根际土壤真菌群落相似性

由表5 可知：仿生种植一年七(SB1)、二年七(SB2) 和三年七(SB3) 3 个处理之间的真菌群落相似性系数平均值为0.72，仿生种植的对照与这3 个处理的相似性系数平均值为0.77。表明仿生种植模式下，随三七种植时间的延长，真菌群落相似性波动不大。

表5 2 种种植模式下三七根际土壤真菌的相似性系数(Cs)Tab.5 The fungi sorenson coefficient (Cs) in P.notoginseng rhizosphere soils of bionic and traditional patterns

而传统种植的二年七(ST2) 和三年七(ST3)2 个处理的真菌群落相似性系数为0.45，表明传统种植三七，随种植时间的延长，真菌群落相似性波动较大，传统种植的对照与这2 个处理的相似性系数平均值为0.67，表明传统种植模式下，未种植三七和种植三七的土壤真菌群落相似性有一定的波动。

2.2.5 三七根际土壤微生物多样性指数

由表6 可知：仿生种植三七根际土壤细菌和真菌的多样性指数平均值分别为0.73 和1.43；并且细菌和真菌表现相似的规律，即种植三七后，多样性指数呈下降趋势，表明仿生种植三七后，根际土壤微生物随种植时间的延长而发生改变，多样性指数呈下降趋势。

表6 2 种种植模式下三七根际土壤微生物的多样性指数(H′)Tab.6 The Shannon diversity index (H′) in P.notoginseng rhizosphere soils microorganisms of bionic and traditiona patterns

传统种植三七根际土壤细菌和真菌的多样性指数平均值分别为0.86 和1.07；细菌多样性并没有较大的变化，而真菌的多样性则随种植时间延长而升高，表明传统种植有利于三七根际真菌群落的生长。

3 讨论

3.1 仿生种植对三七根际土壤微生物数量的影响

许多学者均认为：土壤微生物群落是反映土壤肥力的一项指标，细菌型土壤是土壤肥力提高的生物指标之一，而真菌型土壤是肥力衰竭的标志[21-22]。本研究通过对土壤微生物的数量进行分析，结果发现：传统种植模式下，随种植年限的延长，三七根际土壤细菌数量减少，真菌数量增多，土壤微生物由细菌型向真菌型转变，这与郭金瑞等[23]的研究相一致。但是仿生种植模式下，三七根际土壤中细菌数量保持在一个较高水平，且呈逐年增多趋势，土壤中真菌/细菌比值相应降低，这与乔艳等[24]的研究结果一致。土壤生态学的研究认为：农业生产中，减少复合肥的使用，配施有机肥和微生物菌肥，可以改善土壤理化性状，保障土壤养分的平衡，为许多物种提供适宜的生长环境，避免单一物种的爆发性生长或某些物种因不能适应环境变化而死亡[25-27]。由此可见，仿生种植可以促进细菌的生长，使土壤呈现细菌型土壤，反映土壤肥力的提高。但是本研究缺乏关于反映土壤肥力的研究，有待进行相关探究。

3.2 仿生种植对三七根际土壤微生物群落结构的影响

现有研究表明：根际土壤微生物多样性对维持土壤健康和抑制植物病害非常重要，土壤微生物的失调和病原菌的积累正是三七连作障碍形成的主要原因之一[20-28]。本研究表明：随着三七的连续种植，仿生种植模式可以丰富土壤细菌的种类，有效地降低土传病害病原真菌镰刀菌的累积，为三七的生长提供健康的土壤环境。根据仿生种植模式中肥料管理的方法，产生这种现象的原因可能是由于有机肥和微生物菌肥的施用造成的。施入有机肥料改变了土壤中微生物群落组成结构，提高其物种丰富度和功能多样性，加强对病原生物的抵御能力，从而减轻土传病害的发生[29]。有机肥的添加，一方面可以丰富土壤微生物的种类，另一方面有益微生物的定植，可以作为植物根际的优势菌群，通过与真菌和病原微生物竞争养分或直接分泌致死物质，以保证根际微生物区系的健康发展[30]。同时传统种植过程中，农药的施用虽然可以对土传病害的发生起到防控作用，但是在长期的进化过程中，不耐药的微生物难以继续生存，而病原菌在世代交替中形成耐药性，加剧了病害的发生[31-33]。仿生种植则不存在这种弊端。总的来讲，仿生种植保持了土壤微生物菌群的多样性和平衡性，减少了土传病害病原菌的积累。