HPLC梯度洗脱法同时测定慢肝解郁胶囊中8种成分的含量△

沈晓庆，韦杏

1.辽宁中医药大学 附属医院 药学管理部，辽宁 沈阳 110032；2.广西中医药大学，广西 南宁 530001

慢肝解郁胶囊收载于《中华人民共和国药典》2015年版一部，由柴胡、丹参、延胡索等13味中药加工而成，主要用于肝区胀痛、胸闷不舒、食欲不振、腹胀便溏所属肝郁脾虚症、迁延性肝炎或慢性肝炎等病症的治疗[1]1685。临床研究表明，慢肝解郁胶囊对慢性肝炎治疗效果显著[2]，其联合复方鳖甲软肝片能明显减轻代偿期肝硬化患者的临床症状，改善肝纤维化程度，提高患者生存质量，提高临床疗效[3-4]。长期的临床实践证明，中药及其制剂具有显著的临床疗效，中药不是单一的有效成分，其发挥疗效的作用机制和单一化药不同，具有多靶点、多成分、协同作用的特点，慢肝解郁胶囊现行质量标准[1]1684和文献报道[5-6]中仅对其所含单成分芍药苷、丹酚酸B分别进行测定，暂未检索到对该制剂君药柴胡及其他药味所含多个指标成分进行同时控制的文献报道，难以实现对慢肝解郁胶囊产品进行全面质量控制。本研究参考中药质量标志物优选原则，首次采用高效液相色谱法(HPLC)梯度洗脱法对慢肝解郁胶囊所含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱含量进行同时测定，为更加全面地评价慢肝解郁胶囊的整体质量，指导药品生产企业不断优化生产工艺控制参数，确定原药材产地来源、采收季节等提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；MS205DM型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 试药

对照品柴胡皂苷a(批号：110777-201912，纯度：94.8%)、柴胡皂苷d(批号：110778-201912，纯度：96.3%)、隐丹参酮(批号：110852-201807，纯度：99.0%)、丹参酮ⅡA(批号：110766-201721，纯度：99.5%)、延胡索乙素(批号：110726-201819，纯度：99.8%)均购自中国食品药品检定研究院；对照品丹参酮Ⅰ(批号：17051706，纯度：99.9%)、紫堇碱(批号：17110821，纯度：99.6%)均购自上海同田生物技术股份有限公司；对照品去氢紫堇碱(批号：CFS201901，纯度：98.0%)购自武汉天植生物技术有限公司；乙腈为色谱纯；其他试剂为分析纯。

慢肝解郁胶囊(规格：0.25 g/粒；批号分别为1904001、1905002、1907001)均来源于吉林敖东延边药业股份有限公司。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1对照品储备液和混合对照品溶液制备 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱对照品适量，精密称定，用70%乙醇制成质量浓度分别为0.682、0.516、0.198、0.154、0.396、0.634、0.578、0.362 mg·mL-1的单组分对照品储备液；精密吸取上述溶液各2.5 mL，用70%乙醇定容至50 mL，制成含柴胡皂苷a 34.1 μg·mL-1、柴胡皂苷d 25.8 μg·mL-1、隐丹参酮9.9 μg·mL-1、丹参酮Ⅰ 7.7 μg·mL-1、丹参酮ⅡA19.8 μg·mL-1、延胡索乙素31.7 μg·mL-1、去氢紫堇碱28.9 μg·mL-1、紫堇碱18.1 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液和阴性样品溶液制备 取慢肝解郁胶囊内容物，取研细后细粉2.0 g，精密称定，精密加入70%乙醇25 mL，称质量，加热回流提取30 min，放冷后用70%乙醇补足减失质量，滤过，制成慢肝解郁胶囊供试品溶液；按慢肝解郁胶囊处方和制法分别制备缺柴胡、缺丹参和缺延胡索的阴性样品，再按上述方法制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件及专属性试验

色谱柱：Waters SunFire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：30 ℃；流动相：乙腈(A)-0.1%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，25%A；10～18 min，25%～42%A；18～32 min，42%～65%A；32～47 min，65%～78%A；47～55 min，78%～25%A)，流速：1.0 mL·min-1；检测波长分别为210 nm[7](0～18.0 min检测柴胡皂苷a和柴胡皂苷d)和280 nm[8-11](18.0～55.0 min检测隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱)；进样量：10 μL。精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，进样测定并记录色谱图。结果慢肝解郁胶囊中8种成分峰形对称，理论塔板数按各成分峰计均≥4500，分离度均大于1.5，在与对照品相应的保留时间处，柴胡阴性样品溶液色谱图中未见柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色谱峰，丹参阴性样品溶液色谱图中未见隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA色谱峰，延胡索阴性样品溶液色谱图中未见延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱色谱峰，表明阴性样品对慢肝解郁胶囊中8种成分的同时测定无干扰，见图1。

注：A.混合对照品；B.慢肝解郁胶囊；C.柴胡阴性样品(批号：1904001)；D.丹参阴性样品；E.延胡索阴性样品；1.柴胡皂苷a；2.柴胡皂苷d；3.隐丹参酮；4.丹参酮Ⅰ；5.丹参酮ⅡA；6.延胡索乙素；7.去氢紫堇碱；8.紫堇碱。图1 慢肝解郁胶囊混合对照品、样品及阴性样品HPLC图

2.3 线性关系考察

精密吸取2.1.1项下单组分对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，用70%乙醇定容至20 mL，制成6个质量浓度梯度的线性考察混合对照品溶液Ⅰ～Ⅵ(柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱质量浓度见表1)，依法进样测定，以待测成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 慢肝解郁胶囊中8种成分的线性考察混合对照品溶液质量浓度及线性关系考察结果

2.4 精密度考察

取混合对照品溶液连续进样6次，测得柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱峰面积的RSD分别为0.56%、0.83%、1.12%、1.25%、1.01%、0.66%、0.71%和0.98%。

2.5 重复性考察

取同一批次慢肝解郁胶囊(批号：1904001)6份制备供试品溶液，依法进样测定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱的峰面积，计算得8种成分含量的RSD分别为1.21%、1.44%、1.75%、0.87%、1.52%、1.36%、0.29%和1.60%。

2.6 稳定性考察

取同一份慢肝解郁胶囊(批号：1904001)供试品溶液，于0、2、4、8、12、18 h进样检测柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱的峰面积，结果慢肝解郁胶囊供试品溶液18 h内稳定，8种成分峰面积的RSD分别为0.57%、0.79%、1.10%、1.19%、0.97%、0.64%、0.73%和0.95%。

2.7 加样回收率试验

取含量已知的慢肝解郁胶囊(批号：1904001)样品适量，倾出内容物研细，取9份，每份1.0 g，精密称定，精密加入根据慢肝解郁胶囊各成分含量配制的混合对照品溶液(柴胡皂苷a 0.378 mg·mL-1、柴胡皂苷d 0.296 mg·mL-1、隐丹参酮0.118 mg·mL-1、丹参酮Ⅰ 0.084 mg·mL-1、丹参酮ⅡA0.236 mg·mL-1、延胡索乙素0.352 mg·mL-1、去氢紫堇碱0.324 mg·mL-1、紫堇碱0.196 mg·mL-1)0.5、1.0、1.5 mL各3份，再按2.1.2项下方法制成供试品溶液，依法进样检测柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱的峰面积，计算各成分的加样回收率及RSD，结果见表2。

表2 慢肝解郁胶囊中8种成分的加样回收率试验结果

续表2

2.8 样品含量测定

取3批的慢肝解郁胶囊样品适量，按2.1.2项下方法每批制备3份供试品溶液，依法进样测定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱的峰面积，计算各成分的含量，结果见表3。

表3 慢肝解郁胶囊样品含量测定结果 mg·g-1

3 讨论

3.1 指标成分的选择

慢肝解郁胶囊由柴胡、延胡索、当归、香橼、白芍、川楝子、丹参、白术、茯苓、甘草、三棱、麦芽、薄荷13味中药配伍而来，方中柴胡疏肝解郁、升举阳气，为君药；延胡索、香橼、川楝子理气疏肝、活血止痛，当归、白芍养血和血、柔肝疏肝，合为臣药；丹参、三棱活血行气、消积止痛，白术、茯苓健脾祛湿、益气和中，薄荷疏肝行气，麦芽健脾和胃，合为佐药；甘草调和诸药，为使药。诸药合奏，以达疏肝解郁、健脾养血之功。本研究参考中药质量标志物确认原则，选取慢肝解郁胶囊君药柴胡代表性成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，臣药延胡索活性成分延胡索乙素、去氢紫堇碱和紫堇碱，佐药丹参[12]特征成分隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA为检测指标成分，以期更加全面地评价慢肝解郁胶囊的内在质量。

3.2 供试品提取方式的确定

考虑到慢肝解郁胶囊方中柴胡、丹参、延胡索、当归、薄荷、三棱、茯苓均细粉直接入药，超声提取难以使待测成分提取完全，故采用加热回流的提取方式对样品进行处理。参考相关文献，对比考察了不同提取溶剂(70%乙醇[10，13]、水[7]、75%甲醇[8-9]、甲醇[11，14-16])对待测成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱综合提取率的影响，结果70%乙醇为提取溶剂时，所测成分综合提取率最佳。对提取时间不断摸索，最终按照2.1.2项下方法对慢肝解郁胶囊进行供试品溶液的制备。

本研究采用HPLC同时测定慢肝解郁胶囊中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、去氢紫堇碱、紫堇碱的含量，方法专属性强、操作便捷、结果准确，为更加全面地评价慢肝解郁胶囊内在产品质量提供了数据支持。