天葵子UPLC指纹图谱建立及指标性成分测定△

刘晓霞，丁青，陈芳，梁月仪，王利伟，李乐，孙冬梅

广东一方制药有限公司 广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

天葵子为毛茛科植物天葵Semiaquilegiaadoxoides(DC.)Makino的干燥块根，夏初采挖，洗净、干燥，除去须根[1]。天葵子味甘、苦，性寒，归肝、胃经，具有清热解毒、消肿散结、利水通淋之功效，用于治疗痈肿疗疮、乳痈、痕病、毒蛇咬伤等证[2]。根据文献报道，天葵子中化学成分主要为内酯类[3]、生物碱类[4]、氰基与硝基类[5]。其中，内酯类的代表性成分主要有格列风内酯、耧斗菜内酯、蝙蝠葛内酯等，生物碱类的代表性成分主要有木兰花碱、唐松草酚定、天葵碱A等，氰基与硝基类代表性成分主要有紫草氰苷等手性化合物。在《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版中收载的天葵子药材质量标准中包括来源、性状、鉴别、检查(水分、总灰分、酸不溶性灰分)、浸出物等项目，但是缺乏相关指标性成分含量测定与指纹图谱研究，难以全面评价药材质量。本研究采用超高效液相色谱法(UPLC)对10批天葵子药材进行研究，初步建立了天葵子指纹图谱，并在此基础上同时测定格列风内酯和木兰花碱的含量，以期为天葵子药材质量的整体评价及临床应用提供参考。

1 材料

1.1 试药

共收集10批天葵子药材，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定均为毛茛科植物天葵Semiaquilegiaadoxoides(DC.)Makino的干燥块根。样品信息见表1。

表1 天葵子药材样品信息

对照品格列风内酯(批号：18091205，纯度：98.29%，成都普菲德生物股份有限公司)；对照品紫草氰苷(批号：63492-69-3，纯度：99.6%，上海诗丹德标准技术服务有限公司)；对照品木兰花碱(批号：wkq17063003，纯度：98%，四川省维克奇生物科技有限公司)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、乙腈和甲醇(默克股份有限公司)均为HPLC级；水为超纯水(实验室自制)；甲醇(分析纯，西陇科学股份有限公司)。

1.2 仪器

Vanquish型超高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；1290型超高效液相色谱仪(安捷伦公司)；ACQUITY HSS T3型色谱柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司)；ME204E型万分之一天平、XP26型百万分之一天平(梅特勒-托利多公司)；HWS-28型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用ACQUITY HSS T3型色谱柱，以甲醇(A)-0.05%磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～12 min，100%～94%B；12～47 min，94%～40%B)；流速为0.25 mL·min-1；柱温为15 ℃；检测波长为260 nm，进样量为1 μL。

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取对照品格列风内酯、紫草氰苷、木兰花碱适量，置于50 mL量瓶中，加70%甲醇分别制成含格列风内酯0.04 mg·mL-1、紫草氰苷0.04 mg·mL-1、木兰花碱0.04 mg·mL-1的对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备

取本品粉末(过二号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱

2.4.1精密度试验 取天葵子药材供试品溶液(批号：TKZ04)，按2.1项下色谱条件重复进样6次，进样体积1 μL，以紫草氰苷峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD。各特征峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积RSD均小于3%，结果表明，仪器精密度良好。

2.4.2重复性试验 取天葵子药材供试品(批号：TKZ04)溶液，按2.3项下供试品制备溶液方法制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，以紫草氰苷峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD。各特征峰的相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积RSD均小于3%，结果表明，分析方法重复性良好。

2.4.3稳定性试验 取天葵子药材供试品(批号：TKZ04)溶液，于室温下放置，分别在制备后0、2、9、16、22、24 h后按照2.1项下色谱条件进样测定，以紫草氰苷峰为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD。各特征峰的相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于3%，结果表明，24 h内供试品溶液的稳定性较好。

2.4.4指纹图谱的建立 精密称取不同批次天葵子药材约1.0 g，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行共有峰匹配(图1)，生成对照指纹图谱(图2)。结果显示，天葵子药材指纹图谱具有17个共有峰，采用UPLC-二极管阵列检测器(DAD)，根据对照品指认了3个特征峰，其中5号峰为格列风内酯、7号峰为紫草氰苷、14号峰为木兰花碱。计算不同批次天葵子药材样品指纹图谱相似度，其相似度均大于0.9，见表2，说明不同批次间的一致性与重复性较好。

图1 天葵子样品UPLC指纹图谱叠加图

注：5.格列风内酯；7.紫草氰苷；14.木兰花碱。图2 天葵子样品UPLC对照指纹图谱

表2 天葵子样品UPLC指纹图谱相似度结果

2.5 含量测定

2.5.1专属性考察 精密吸取天葵子药材供试品(批号：TKZ04)溶液、对照品溶液与空白溶剂，按2.1项下色谱条件注入液相色谱仪，进样测定。结果见图3。结果表明，空白溶剂色谱中在与格列风内酯、木兰花碱相应的保留时间位置上没有色谱峰，表明提取溶剂对格列风内酯、木兰花碱的含量测定无干扰，表明专属性良好。

注：1.格列风内酯；2.木兰花碱。图3 天葵子样品、对照品和空白溶剂UPLC图

2.5.2线性关系考察 精密称取对照品格列风内酯5.339 mg、木兰花碱5.246 mg，置10 mL量瓶中，加70%甲醇制成含格列风内酯524.770 μg·mL-1、木兰花碱514.108 μg·mL-1的混合对照品储备液。

分别精密量取上述混合对照品储备液0.1、0.5、1.0、1.0、3.0 mL分别置于100、100、10、5、5 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，分别制成格列风内酯和木兰花碱系列混合对照品溶液，连同混合对照品储备液，按2.1项下色谱条件进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，以测得的峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归计算，绘制标准曲线。格列风内酯回归方程为Y=0.418 6X-0.239 2，r=1.000 0，格列风内酯质量浓度在0.525～524.770 μg·ml-1与峰面积线性关系良好；木兰花碱回归方程为Y=0.099 4X-0.055 3，r=0.999 7，木兰花碱质量浓度在0.514～514.110 μg·ml-1与峰面积线性关系良好。

2.5.3精密度试验 精密吸取2.2项下对照品溶液，按2.1项下色谱条件重复进样6次。计算峰面积RSD。结果显示，格列风内酯峰面积RSD为0.41%，木兰花碱峰面积RSD为0.62%，表明仪器精密度良好。

2.5.4重复性试验 取同一批次天葵子药材样品(批号：TKZ04)，按2.3项下方法制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果显示，格列风内酯平均质量分数为0.22 mg·g-1，RSD为2.24%；木兰花碱平均质量分数为0.61 mg·g-1，RSD为2.77%，表明分析方法重复性良好。

2.5.5加样回收率试验 采用对照品进行加样回收率测定，按对照品格列风内酯、木兰花碱加入量与供试品溶液中待测成分格列风内酯、木兰花碱含量为0.5∶1、1∶1、1.5∶1设计3组试验，每组平行3份，分别精密移取适量的格列风内酯对照品储备液、木兰花碱对照品储备液，在氮吹仪下吹干。取已知含量的天葵子药材(批号：TKZ04)粉末(过二号筛)约0.5 g，精密称定，置3组锥形瓶中，每组平行3份，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，分别计算回收率和RSD，见表3。结果显示，天葵子药材中格列风内酯含量测定分析方法回收率为92.27%～98.36%，RSD为2.13%，木兰花碱含量测定分析方法加样回收率为89.69%～95.81%，RSD为2.31%，符合《中国药典》2020年版9101药品质量标准分析方法验证指导原则要求。

表3 天葵子药材中格列风内酯和木兰花碱含量测定加样回收率试验

2.5.6稳定性试验 取天葵子药材供试品(批号：TKZ04)溶液，于室温下放置，分别在制备后0、2、9、16、22、24 h后按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算RSD。结果显示，在24 h内进样测定格列风内酯含量RSD为1.32%；木兰花碱含量RSD为0.97%，表明24 h内供试品溶液的稳定性较好。

2.5.7样品测定 对10批天葵子药材按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，格列风内酯、木兰花碱含量测定结果见表4。

表4 10批天葵子药材样品含量测定结果(n=2) mg·g-1

3 讨论与结论

已有研究采用HPLC测定天葵子中格列风内酯、东方唐松草苷的含量[6-7]。本课题组前期研究发现，天葵子中氰基类化合物手性异构体之间在受热条件下存在转化，故暂不作为含量测定指标。鉴于其化学成分尚缺乏有效性研究报道，选择稳定性较好且含量相对较高的格列风内酯、木兰花碱作为测定指标。10批天葵子药材格列风内酯质量分数为0.15～0.39 mg·g-1，木兰花碱质量分数为0.59～2.22 mg·g-1。

本研究采用UPLC建立天葵子指纹图谱及含量测定方法，结果显示，该方法操作简单、重复性好；色谱分离时，降低柱温能使氰基类化合物手性异构体有效分离；在流动相中加入适量的磷酸，能使相似组分有较好的峰形和分离度。分别考察了不同水相(0.1%磷酸、0.05%磷酸和0.1%甲酸)、2种不同类型色谱柱[Waters ACQUITY HSS T3(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY CORTECS T3(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)]，还比较了不同检测波长(221、260、300 nm)、不同柱温(13、15、18 ℃)、不同流速(0.20、0.25、0.30 mL·min-1)对天葵子指纹图谱色谱峰的影响。结果显示，采用Waters ACQUITY HSS T3型(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)色谱柱，以0.05%磷酸为水相，在检测波长260 nm、柱温15 ℃、流速0.25 mL·min-1色谱条件下色谱峰的分离度较好、基线平稳、色谱峰数目较多，且信号响应较高。

通过单因素分析，考察了提取溶剂(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、稀乙醇)、提取方式(超声提取、回流提取)、提取时间(15、30、45 min)对天葵子药材指纹图谱及含量测定的影响，根据结果最终确定最佳供试品制备方法为用70%甲醇加热回流30 min。

本研究通过考察10批不同产地的天葵子药材指纹图谱，确定了17个共有峰，指认了3个，各共有特征峰的相对保留时间一致性较好，但相对峰面积差异较大。不同产地天葵子药材的指纹图谱的整体图貌基本一致，指纹图谱的相似度较高，均大于0.9，说明不同产地天葵子药材的化学组成一致性较好，但含量存在一定差异。本研究在《中国药典》2020年版天葵子药材质量标准基础上，增加了天葵子指纹图谱方法和以格列风内酯、木兰花碱为测定指标的含量测定方法，方法操作简便、重复性好，提升了天葵子药材质量标准，可为提高天葵子药材的质量及保证临床用药有效性提供参考。