生脉饮联合顺铂对气阴两虚型肺癌荷瘤小鼠抗肿瘤作用的研究

赵星雨， 李囿松

1.山西中医药大学研究生院，山西 太原 030024；2.山西白求恩医院，山西医学科学院中医科，山西 太原 030032

据世界卫生组织的统计报告估计，2018年全球新增癌症病例1810万，960万人因癌症死亡[1]。国家癌症中心数据显示，2015年我国新增癌症病例392.9万，并有233.8万人因癌症死亡，其中肺癌发病人数和死亡人数均居恶性肿瘤第1位[2]。据估计，世界范围内每年肺癌新发病例约有180万，死亡病例约为160万，其中中国的新增病例占35.8%，死亡病例占37.6%[3]，肺癌是我国人群中最常见的癌症之一，也是导致癌症死亡的首要原因。肺癌预后不良，在中国5年生存率仅为16.1%[4]，而且80%的初诊肺癌病例为晚期，确诊后的肺癌患者5年生存率低于15%[5]。肺癌不仅严重影响患者的生命质量，而且对患者家属及社会也是极大的消耗，找到切实有效的治疗方法提高肺癌患者的生存率及生命质量意义重大。

目前，肺癌常用的化疗方案为以铂类为基础的方案，如GP方案(顺铂或卡铂联合吉西他滨）、TP方案(顺铂或卡铂联合紫杉醇）或EP(依托泊苷联合顺铂）等治疗方案。顺铂自20世纪70年代用于临床以来，因其抗瘤谱广，对多种恶性肿瘤及许多以往不敏感的难治性肿瘤有效，而且与既往常用的抗癌药如烷化剂和抗代谢药等无交叉耐药，被认为是有效的化疗药，被广泛应用于临床，成为当前最常用的抗癌药物之一。但由于铂类药物在使用中常常会出现严重的副作用，如胃肠道反应(呕吐、腹泻或便秘等）、肾毒性、骨髓抑制和免疫力低下的情况，高昂的治疗费用以及难以忍受的副作用使患者难以长期坚持治疗，临床观察发现，采用化疗药物联合中药制剂治疗肺癌，能取得增效减毒之功效，治疗效果确切[6]。

中医学对癌病的研究由来已久，远在殷墟甲骨文就有“瘤”的记载，中医认为癌瘤的发生多由于正气内虚、感受邪毒、情志怫郁、饮食损伤、素有旧疾等因素，使脏腑功能失调，气血津液运行失常，产生气滞、血瘀、痰凝、湿浊、热毒等病理变化蕴结于脏腑组织，相互搏结，日久渐积而成的一类恶性疾病。中晚期由于癌瘤耗伤人体气血津液，故多出现气血亏虚、阴阳两虚等病机转变，尤以气阴两虚证为多见[7]。生脉饮为中医治疗气阴两虚型疾病的重要方剂，其由人参、麦冬、五味子组成，方中人参甘温，益元气，补肺气，生津液；麦冬甘寒养阴，润肺生津；人参、麦冬合用，则益气养阴之功益彰；五味子酸温，敛肺止汗，生津止渴，共奏益气养阴之功效。本研究拟探讨生脉饮联合顺铂对气阴两虚型Lewis肺癌荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级C57小鼠40只，雌雄各半，年龄4～6周，重量约18～22 g，由山西医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证编号为SCXK(晋）2015-0001。喂养饲料由山西医科大学实验动物中心提供，实验严格遵守国家卫生研究院(NIH）实验动物饲养及使用指南。实验动物采用随机数字表的方法，随机分为模型组、生脉饮组、顺铂组及生脉饮联合顺铂组各10只小鼠。饲养在山西医科大学动物实验中心SPF级实验室。实验前全部小鼠适应性喂养3天，室温22℃～26℃，相对湿度40%～60%，自由饮水、采食。动物室保持安静，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.2 实验细胞株 Lewis肺癌细胞株，由山西医科大学细胞库提供。

1.3 实验药物 生脉饮：规格：10 ml/支，10支/盒，批号：国药准字Z11020363，由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂提供；顺铂：规格：10 mg/支，批号：H20040813，购自江苏豪森药业集团有限公司；兔抗小鼠β-catenin蛋白单克隆抗体，购于Santa Cruz；免疫组化检测SP试剂盒购于武汉华美生物科技有限公司；DAB显色液购于武汉华美生物科技有限公司；造模中药：麻黄、制附子、细辛、天南星各9克，购自山西省中医院，水煎浓缩到1g/ml，冰箱存放。

1.4 实验方法

1.4.1 构建气阴两虚型Lewis肺癌荷瘤小鼠模型

造模方法参考文献[8]方法进行，40只小鼠给予温热性中药灌胃，每只0.4 ml，每天1次，每天灌胃后放置于密闭的玻璃箱中刨花烟熏，每次30 min，小鼠自然吸入，连续10 d，建立气阴两虚模型，第11天，将冻存于液氮中Lewis肺癌细胞取出，复苏培养，使用细胞计数板计数，按照1×107个/mL细胞浓度，0.2 mL/只注射到40只小鼠右侧前肢腋下，全程无菌操作，建立气阴两虚型肺癌实验动物模型，接种后第7天，造模小鼠右腋下均可触及瘤块，即气阴两虚Lewis移植瘤小鼠动物模型建立成功。

1.4.2 Lewis肺癌荷瘤小鼠的分组给药

小鼠接种肿瘤后，待肿瘤生长至第14天时，按不同组别给药，给药方案如下：模型组(A组）：0.2 mL生理盐水灌胃；顺铂组(B组）：0.2 mL腹腔注射，隔天给药1次，共7次；生脉饮组(C组）：0.2 mL灌胃；生脉饮+顺铂组(D组）：0.2 mL生脉饮灌胃+0.2 mL顺铂腹腔注射，隔天给药1次，共7次，以上灌胃均持续14天。

1.5 观察指标

1.5.1 肿瘤抑制率和生命延长率

每天密切观察小鼠生活状态(精神、进食、毛发色泽、活动、聚集现象）和体质量变化，接种肿瘤后，每隔3天用游标卡尺测量肿瘤最长径a和最短径b，单位cm，做详细记录，计算肿瘤体积V(V=ab2/2）。计算肿瘤抑制率=(V阴性对照组-V处理组）/V阴性对照组×100%。同时每天记录C57小鼠平均存活时间T ，计算生命延长率=(T实验组/T对照组-1）×100%。观察期直到所有C57小鼠死亡为止(当肿瘤出现溃疡或皮下肿瘤长至12 mm大小时，也以小鼠死亡对待，断颈处死[9]）。

1.5.2 检测肿瘤组织中β-catenin蛋白表达

免疫组化的步骤：将石蜡切片常规脱蜡水化，脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3% H2O2在室温条件下孵育5～10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性，然后倒掉H2O2，用蒸馏水冲洗两次，以使抗原的位点暴露出来，再用PBS浸泡5分钟(该操作进行2次），擦干组织周围的PBS液，加上血清，使非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时；擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗，用PBS冲洗，置于4℃冰箱中保存过夜；将载玻片取出，放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37℃温箱中半小时；将片子取出,放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干组织周围的PBS后滴加适量辣根酶标记链霉卵白素工作液，然后放入37℃温箱中半小时，放入PBS中洗3次，每次5 min；用DAB显色剂显色3～15分钟后，用自来水充分冲洗；用苏木复染、脱水、透明、封片后，置于显微镜下观察成像。

β-catenin蛋白阳性细胞判断标准：阳性信号是细胞膜呈淡黄至棕黄色颗粒。主要阳性信号集中在细胞膜的细胞＞50%的称为细胞膜表达，在细胞膜表达的细胞＞50%为正常表达，反之为表达缺失。主要阳性信号集中在细胞质的细胞＞50%的称为细胞质表达，主要阳性信号在细胞核的细胞＞10%的称为有核定位。胞质或胞核的表达称为异位表达，胞膜表达的缺失和异位表达统称为异常表达。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 不同处理方法对荷瘤小鼠体质量的影响

由表1可见，各组小鼠初体质量和终体质量无明显差异(P＞0.05），生脉饮和顺铂不影响小鼠的体质量增长。

表1 各组小鼠体质量的变化(±s）Table 1 Changes of body weight of mice in each group

表1 各组小鼠体质量的变化(±s）Table 1 Changes of body weight of mice in each group

组别模型组生脉饮组顺铂组生脉饮+顺铂组只数(只）8 9 8 9初体质量(g）20.53±0.41 20.58±0.39 20.49±0.38 20.56±0.43终体质量(g）34.41±0.46 35.02±0.45 34.37±0.48 33.83±0.64

图1 各组小鼠体质量的变化Figure 1 Changes of body weight of mice in each group

2.2 不同处理方法对小鼠瘤重及抑瘤率的影响

由表2可见，与模型组相比，生脉饮组、顺铂组、(生脉饮+顺铂组）瘤重均减轻(P＜0.05），差异有统计学意义，说明各组均有明显的抑瘤作用；三组间两两相比(P＞0.05），差异均无统计学意义，说明三组在抑制小鼠肿瘤生长的作用方面差异不明显。

表2 各组小鼠瘤重及抑瘤率的比较(±s）Table 2 The tumor weight and tumor inhibiting rate of mice in each group

表2 各组小鼠瘤重及抑瘤率的比较(±s）Table 2 The tumor weight and tumor inhibiting rate of mice in each group

组别模型组生脉饮组顺铂组生脉饮+顺铂组只数(只）8 9 8 9瘤重(g）2.34±0.52 1.83±0.56 1.62±0.47 1.42±0.38抑瘤率(%）0 21.79 30.77 39.32

图2 各组小鼠瘤重及抑瘤率的比较Figure 2 The tumor weight and tumor inhibiting rate of mice in each group

2.3 不同处理方法对小鼠平均存活时间及生命延长率的影响

由表3可见，与模型组相比，各组小鼠平均存活时间均有所延长(P＜0.05），说明各组均有明显的延长生命周期的作用。生脉饮联合顺铂组的小鼠生命延长率为64.26%，而生脉饮组的小鼠生命延长率为51.33%，二者相比，P＜0.05，说明生脉饮联合顺铂组延长生命周期的作用优于生脉饮组，表明中西药联用对延长肺癌小鼠生命周期的作用效果比单独用中药效果好。

表3 各组小鼠平均存活时间及生命延长率的变化(±s）Table 3 Changes of average survival time and life prolongation rate of mice in each group

表3 各组小鼠平均存活时间及生命延长率的变化(±s）Table 3 Changes of average survival time and life prolongation rate of mice in each group

注：与模型组比较，①P＜0.05；与生脉饮组比较，②P＜0.05。

只数(只） 生命延长率(%）51.33 56.27 64.26组别模型组生脉饮组顺铂组生脉饮+顺铂组8 9 8 9平均存活时间(d）26.3±2.1 39.8±3.6①41.1±1.8①43.2±2.4①②

图3 各组小鼠平均存活时间及生命延长率的变化Figure 3 Changes of average survival time and life prolongation rate of mice in each group

2.4 不同处理方法对荷瘤小鼠肿瘤组织β-catenin表达的影响

从表4可以看出，与模型组(87.5%）相比，各组小鼠肿瘤组织β-catenin异常表达率均明显降低，其中，联合用药组的异常表达率最低，为33.3%(P＜0.05），顺铂组与生脉饮组之间无明显差异(P＞0.05）。

表4 各组小鼠β-catenin蛋白表达的比较Table 4 Comparison of β-catenin protein expression of mice in each group

3 讨论

肺癌是临床常见的恶性肿瘤，其发病率不断上升，但生存率较低，化疗药物和外科手术作为主要的治疗手段，对患者的机体功能有一定损害，而中医药在防治肿瘤方面副作用小、安全性高，逐渐展现出其临床优势。

本研究以生脉饮与顺铂为对象，首先探讨了其抗肿瘤效果。结果表明，二者均可使Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤大小降低，存活天数增多，经生脉饮联合顺铂治疗的Lewis肺癌荷瘤小鼠效果更加显著，说明生脉饮联合顺铂对Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长具有显著抑制作用。

生脉饮为中医治疗气阴两虚型疾病的重要方剂，由人参、麦冬、五味子组成，其中，人参的主要活性物质人参皂苷Rg5能抑制多种肿瘤细胞的增殖，诱导癌细胞周期阻滞和凋亡，同时也可增强免疫调节来抑制肿瘤增殖，起到抗肿瘤作用[10]；麦冬的皂苷成分DT-13可通过抑制血管新生达到防治肿瘤的目的，同时可降低细胞黏附，抑制肿瘤细胞的侵袭；此外，从麦冬中提取到的凝集素既可抗肿瘤细胞增殖，又可诱导肿瘤细胞凋亡[11]；五味子酯乙可通过底物竞争性抑制P-gp的药物外排功能和下调其蛋白水平，达到治疗肺癌的目的[12]，“人参－五味子”这一药对配伍通过调控机体激素及致癌物质代谢、免疫耐药、炎症反应，对肺癌发生、转移及耐药发挥防治作用[13]。

β-catenin则是一个与肿瘤发生发展相关的生物学指标，它是一种胞质蛋白，在细胞中起两种作用，其一为组成细胞黏附/肌动蛋白细胞骨架的结构组分。β-catenin能与E-cadherin结合，参与细胞黏附、生长和增殖等过程。二是作为信号转导分子的游离β-catenin在基因转录中起一定作用。大多数β-catenin结合于质膜，介导钙粘素依赖的细胞间粘连，小部分β-catenin存在于胞质与核内，由Wnt信号调节。

所以β-catenin既是一种细胞黏附分子，也是Wnt信号途径重要的效应物，在Wnt信号途径和钙黏蛋白一环连蛋白复合体中都起作用。据文献报道，Wnt/β-catenin信号通路的异常活化与多种癌症相关，包括但不限于肺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌，其中β-catenin作为Wnt信号通路中最关键的转导因子，参与调控细胞凋亡、分化、生长及黏附等过程[14]。在肿瘤组织中，βcatenin是一种促癌因子，β-catenin活化后，下游Cyclin D1、c-Myc等效应分子表达增加，导致肿瘤发生[15]。

本实验结果显示，β-catenin蛋白的异常表达以模型组最高，说明β-catenin蛋白的异常表达是肿瘤生长、扩散的重要因素；与模型组相比，其余各组均有明显下降，说明生脉饮、顺铂均可在一定程度上减少β-catenin蛋白的异常表达；而联合用药组的异常表达最低，说明两种药合用可以显著减少β-catenin蛋白的异常表达，减慢肿瘤组织的生长及扩散的速度。

本实验旨在观察中药生脉饮的抗癌作用，及其与顺铂合用以减毒、增效的作用，并对其机理β-catenin表达的影响进行了初步探讨。因受多种因素的影响，本课题实验尚存在许多不足之处。如只做了各组小鼠的体质量、抑瘤率、生命延长率以及肿瘤组织中β-catenin蛋白的表达的测定，未对其他的免疫指标进行测定，研究不够广泛。

综上所述，生脉饮联合顺铂使用具有一定的抗肿瘤作用，可以用来治疗气阴两虚型肺癌，二者联用或可通过减低化疗药物的毒性和提高化疗药物的疗效来抑制肿瘤的生长和转移，达到一定的治疗目的，提高患者生存质量，可以尝试在临床上推广使用。