小麦NF-YB型转录基因TaNF-YB4介导植株抵御干旱功能研究

2021-06-11杜萍萍赵颖佳史桂清

河北农业大学学报 2021年2期

杜萍萍，赵颖佳，史桂清，肖凯

( 河北农业大学农学院，河北保定 071001)

小麦等禾谷类作物生长过程中植株经常会遭受干旱逆境胁迫，造成作物生长发育和产量形成能力的限制［1-2］。提高作物植株对干旱逆境抵抗能力，对于促进我国水资源可持续利用和农业可持续发展具有重要实践意义。

转录因子（Transcription factor）通过与下游基因启动子区顺式作用元件（Cis-element）特异性结合，调控基因的转录效率，在增强植株抵御干旱逆境能力中发挥重要作用［3-4］。近年来研究表明，核因子Y（NF-Y）是植物种属转录因子中的1个重要家族。该因子由NF-YA、NF-YB和NF-YC 3种亚基组成［5-6］。其中，NF-YA亚基含有1个负责与NFYB/NF-YC结合的N端结构域和1个特定识别下游基因启动子区CCAAT元件的C-末端结构域［7-8］。当NF-YB和NF-YC亚基与NF-YA形成三聚体复合物后，通过后者识别下游基因CCAAT元件，与靶基因DNA互作，启动基因的转录［9-10］。

迄今，有关NF-Y转录因子参与调控植株生长、发育和逆境防御的研究已有较多报道。Kumimoto等证实，拟南芥植株诱导开花时NF-YB3和NF-YB2表达增强，上述基因参与植株成花特性的调节［11］。部分NF-Y亚基通过调控下游基因转录，参与豆科作物植株根瘤形成、始花期、蓝光反应和叶绿体发育的调控［12-15］。拟南芥NF-YB2和玉米中该基因的同源基因ZmNF-YB2通过增强干旱逆境下植株光合碳同化和干旱适应生理过程，在介导植株抵御干旱逆境中发挥重要作用［15］。上述研究表明，NF-Y家族转录因子广泛参与了植株生长、发育和逆境响应生物学过程。

尽管前人围绕植物种属NF-Y家族转录因子基因分子特征和生物学功能开展了较多研究［12-15］，但迄今有关小麦该家族基因的功能鉴定仍报道较少。本研究以实验室前期小麦干旱转录组分析中鉴定的1个归属于NF-YB家族成员（TaNF-YB4）为基础，对该基因分子特征、应答干旱逆境表达模式及其介导植株抵御干旱逆境的能力进行了鉴定，以期通过本项研究丰富小麦抗旱分子机理的认识，为今后小麦抗旱遗传改良和节水栽培实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 TaNF-YB4分子特征分析

作者前期通过对小麦干旱胁迫后的根系进行高通量转录组分析，鉴定了1个归属于NF-YB转录因子家族基因TaNF-YB4（登录号：AK457878.1，因其与已报道植物种属NF-YB4序列同源予以命名）。利用ExPASY（https://web.expasy.org/protparam/）在线分析工具，对TaNF-YB4编码蛋白的分子量（MW）和等电点（pI）进行预测。利用DNAMAN生物学软件进行供试基因编码蛋白与不同植物种属同源蛋白保守序列多重氨基酸序列比对分析。以TaNF-YB4作为对象进行GenBank数据库（NCBI）同源查找，获得与目标基因同源的不同种属基因。采用MEGA 7软件建立了TaNF-YB4与其植物种属同源基因的系统进化树。

1.2 TaNF-YB4应答干旱胁迫逆境表达模式鉴定

以小麦品种‘石麦22’为材料，参考实验室建立的小麦幼苗水培方法（Hoagland营养液）培养小麦幼苗至三叶期。然后将幼苗转入含有10%聚乙二醇（PEG-6000）营养液进行模拟干旱处理。处理1、3、9、27 h后收取根、叶样本。此外，为鉴定TaNF-YB4表达对恢复处理的响应，将部分经过27 h干旱处理的幼苗再度转入正常营养液内培养，经3 h（R3 h）、9 h（R9 h）和27 h（R27 h）恢复处理后，分别收获根、叶样本。以干旱处理前（0 h）根、叶样本做对照。采用TRIzol试剂盒参照说明书提取根、叶样本RNA，用反转录酶M-MLV进行提取RNA中mRNA反转录，进而以转录合成的cDNA作为实时定量PCR的模板。用于扩增TaNF-YB4的正向引物为5'- CCATCTCCGTCCATCTCCCTCC，反向引物为5'- TACCTTACACGAGCGAAAGACTG。

1.3 正反义表达TaNF-YB4烟草转化株系建立

采用DNA重组技术构建将TaNF-YB4正、反义序列融合至双元表达载体pCAMBIA3301的双元表达载体。其中，扩增靶基因正义序列引物为5'- AAAAGATCTGATGTCGGAGGCGGTGGGC（正向）和5'- AAAGGTTACCTTACACGAGCGAAAG（反向）；扩增靶基因反义序列引物为5'- AAAAGATCTTGGAAAAGGCGTATCTCT（正向）和5'- AAAGGTAACCATCTCCCTCCTAATTA（反向）。参照Sun等［16］的方法建立正、反义表达TaNF-YB4的烟草转化株系。

1.4 TaNF-YB4烟草转化株系干旱处理下植株形态性状鉴定

将野生型对照（WT）、TaNF-YB4正义表达典型株系（Sen 1）和反义表达典型株系（Anti 2）与Hoagland营养液中正常培养。五叶期时，选取长势一致的WT和转化株系幼苗，进行正常营养液处理（对照组）和干旱处理（营养液内补充5% PEG-6000）。处理期间每5 d更换一次营养液。处理4周后用相机拍照记录不同处理下各供试材料植株长势。此外，选取处理后代表性WT、正义系和反义系各3株，用叶面积仪测定植株叶面积后称取鲜重，再将植株样本烘干称重获得植株干质量。

1.5 TaNF-YB4烟草转化株系应答干旱的气孔关闭特征鉴定

选取代表性WT、正义系和反义系植株，在含有5% PEG-6000营养液内进行干旱处理。利用显微镜观测处理前对照（0 h）和处理后不同时间点（0.25、0.5和1 h）叶片气孔开度。各材料不同处理时间点观测气孔样本数量均为50个，以典型气孔观测结果表示气孔开度特征。

1.6 TaNF-YB4烟草转化株系生理生化指标测定

以正常培养和干旱处理 4 周后WT、Sen 1和Anti 2植株为样本，参照 guo等的方法测定光合参数，包括光合速率（Pn）、胞间 CO2浓度（Ci）、光系统 II 光化学活性（ΨPSII）和叶绿体光化学淬灭系数（NPQ）［17］。参照Du等的方法测定可溶蛋白和可溶性糖含量［18］。参照Huang等的方法测定细胞活性氧稳态相关参数，包括超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和过氧化物酶（POD）活性［19］。

1.7 数据统计学分析

采用Microsoft Excel和DPS 7.05软件进行数据处理和统计分析。各测定数据均源于3次测试重复结果。

2 结果与分析

2.1 TaNF-YB4分子特征

TaNF-YB4（登录号AK457878）cDNA序列全长为1 018 bp，其开放阅读框为411 bp，编码136个氨基酸残基多肽链。TaNF-YB4蛋白分子量为14.93 kD，等电点（pI）为5.65。蛋白保守域预测表明，TaNF-YB4蛋白含有1个NF-YB型转录因子家族成员具有的保守H4超家族结构域（图1A）和核定位信号区（aa19～aa83）（图1B）。基因系统进化分析结果显示，在核苷酸水平上，TaNF-YB4与源于油棕、菠萝、大麦、普通小麦、一粒小麦、水稻和粟等植物的NF-YB型转录因子家族基因高度同源（图1C）。表明上述基因可能具有相似的进化途径。

2.2 TaNF-YB4应答干旱胁迫表达模式

与正常生长条件下小麦根系和叶片TaNF-YB4相对较低的转录水平相比，干旱处理下该基因表达上调，在根叶中均表现在干旱处理27 h时间内随着处理进程TaNF-YB4表达水平不断增高（图2）。将干旱处理27 h植株转入正常生长的恢复处理后，在根叶该基因的表达水平下调，呈随着恢复处理进程表达水平不断降低特征（图2）。上述结果表明，TaNF-YB4转录呈典型的干旱逆境应答模式。

图 1 TaNF-YB4分子特征Fig. 1 Molecular characterization of TaNF-YB4

图2 干旱处理下根叶TaNF-YB4表达模式Fig. 2 Expression patterns of TaNF-YB4 in roots and leaves under drought treatment

2.3 干旱处理下TaNF-YB4转化株系表型和植株生长特征

正常培养条件下，与野生型对照（Wild type, WT）相比，TaNF-YB4正义表达株系（Sen 1）和反义表达株系（Anti 2）植株长势相近（图3）。干旱处理下，与WT相比，Sen 1植株长势显著增强，而Anti 2植株长势明显减弱（图3）。上述结果表明，TaNF-YB4在植株响应干旱逆境过程中发挥正向调控作用。

图3 正常生长和干旱处理下TaNF-YB4转化株系植株长势Fig. 3 Growth of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

对不同处理下转化株系和WT植株形态学性状测试取得与植株表型特征相吻合结果。正常生长条件下，转化株系（Sen 1和Anti 2）单株鲜重、干质量和叶面积与WT相比无明显改变（图4）。干旱处理下，与WT相比，Sen 1单株鲜重、干质量和叶面积显著增大，而Anti 2上述植株形态学性状则较WT显著降低（图4）。

图4 正常生长和干旱处理下TaNF-YB4转化株系形态学性状Fig. 4 Morphological traits of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

2.4 干旱处理下转化株系叶片气孔关闭特征

通过气孔显微观测，明确了遗传转化TaNF-YB4对干旱处理下气孔运动特性的影响。与WT相比，Sen 1株系气孔在1 h 内干旱处理下表现为随着处理进程气孔关闭速率加快，在干旱处理0.5～1 h期间其气孔开度明显小于WT植株（图5）。

图5 干旱处理下TaNF-YB4转化株系气孔关闭特征Fig. 5 Stomatal closure properties of the TaNF-YB4 transgenic lines under drought treatment

与Sen 1表现相反，Anti 2株系气孔在1 h内干旱处理下表现为随着处理进程气孔关闭速率减慢（图5）。上述结果表明，TaNF-YB4通过调控植株气孔在干旱处理下的气孔关闭，在一定程度上调控植株蒸腾和保水能力。

2.5 干旱处理下转化株系光合特性、可溶蛋白和可溶性糖含量

正常处理下，TaNF-YB4转化株系（Sen 1和Anti 2）光合参数、可溶蛋白及可溶性糖含量与WT相比无明显差异（图6、图7）。干旱处理下，与WT相比，Sen 1 株系的叶片光合速率和ΨPSII功能、可溶蛋白和可溶性糖含量速率（Pn）以及光系统 II光化学效率（ФPSII）显著增高，胞间CO2浓度（Ci）和NPQ降低，可溶蛋白和可溶性糖含量增加；Anti 2上述生理参数的表现则与Sen 1相反（图6、图7）。表明TaNF-YB4对干旱逆境下植株的光合特性和碳氮代谢能力具有重要影响。

图6 正常生长和干旱处理下TaNF-YB4转化株系形态学性状Fig. 6 Photosynthetic parameters of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

图7正常生长和干旱处理下TaNF-YB4转化株系可溶蛋白和可溶性糖含量Fig. 7 Soluble protein and sugar contents of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

2.6 干旱处理下转化株系细胞保护系统参数

正常处理下，TaNF-YB4转化株系（Sen 1和Anti 2）SOD活性、CAT活性、POD活性和MDA与WT无明显差异（图8)。

干旱处理下，与WT相比，Sen 1株系上述细胞保护酶活性增高，MDA 含量降低；而Anti 2 株系上述细胞保护酶活性降低，MDA 含量增高（图8)。上述结果表明，TaNF-YB4通过参与干旱胁迫下细胞活性氧（ROS）稳态的调控，参与植株对干旱逆境的抵御过程。

图8 正常生长和干旱处理下TaNF-YB4转化株系细胞活性氧稳态相关参数Fig. 8 Cellular ROS-associated parameters of the TaNF-YB4 transgenic lines under normal growth and drought treatments

3 讨论

NF-Y型转录因子家族基因在植株生长、发育和非生物逆境响应和适应过程中发挥重要的调控效应［12-15］。其中，部分该家族成员如大豆GmNF-YA3和白杨pdNF-YB7呈干旱胁迫下诱导表达模式，在介导植株抵御干旱逆境中发挥重要功能［20,21］。本研究对归属与小麦NF-YB家族基因TaNF-YB4分子特征、应答干旱胁迫表达和遗传转化调控植株适应干旱逆境的功能研究表明，该小麦NF-Y家族成员具有NF-YB蛋白通常具有的保守H4超家族结构域和核定位信号区，其转录水平呈干旱诱导模式，表明该转录因子基因通过上调表达，参与下游基因转录调节，进而参与植株适应和抵御干旱逆境的生物学过程。通过基因遗传转化株系抵御干旱逆境能力的鉴定，本研究证实TaNF-YB4上调表达后显著增强植株抵御干旱逆境的能力。

植株抵御干旱能力的增强，与植株干旱胁迫下维持较高的光合碳同化能力、较强的蛋白和碳水化合物代谢密切相关［17］。在本研究中，通过对干旱处理下的TaNF-YB4正义和反义株系光合参数、可溶蛋白含量和可溶性糖含量的测试结果表明，与野生型对照（WT）植株相比，正义表达小麦供试基因典型株系（Sen 1）的光合能力和碳氮代谢能力显著增强。与此相反，反义表达TaNF-YB4株系的光合能力和碳氮代谢水平较WT明显降低。因此，维持较强干旱逆境下植株光合碳同化和碳氮代谢水平，是TaNF-YB4改善植株抵御干旱逆境能力的重要生理基础。

通过调节植株叶片气孔开闭特性，是减少干旱胁迫下植株蒸腾失水、进而增强植株适应干旱逆境的重要机制［18］。研究证实，部分干旱防御基因通过脱落酸（ABA）依赖途径，调控参与气孔运动的ABA相关基因表达，促进干旱逆境下的气孔关闭速率［15］。白杨pdNF-YB7提高植株抗旱能力与其调控气孔开闭及维持逆境下较高细胞水势有关［22］。本研究表明，TaNF-YB4参与了干旱胁迫下植株气孔运动的调节，正义表达该基因株系干旱处理下气孔关闭速率加快，在减少干旱胁迫下植株水分丧失、维持相对较高细胞水势，进而增强植株抵御干旱胁迫过程发挥重要作用。有关TaNF-YB4调控的气孔运动相关基因和生理机制有待进一步探讨。

遭遇干旱胁迫后，植株体内诱发活性氧清除酶的合成，SOD、CAT和POD等细胞保护酶活性增强，能有效清除逆境诱发的活性氧，维持逆境下植株活性氧相对较低水平及较强的植株代谢功能［21］。本研究对干旱处理下转化株系的细胞活性氧稳态相关参数进行测试分析表明，正义表达TaNF-YB4株系（Sen 1）较WT的细胞保护酶（SOD、CAT和POD）活性增强，细胞膜质过氧化产物丙二醛（MDA）含量降低。这表明，TaNF-YB4具有改善干旱逆境下植株活性氧清除能力，缓解细胞膜质过氧化，进而改善干旱逆境下植株碳氮代谢、光合碳同化和植株抵御干旱逆境能力。该基因可作为小麦种质抗旱能力强弱的重要分子评价指标。