定量蛋白质组学在慢性嗜酸细胞性鼻窦炎的应用分析

杨念念，杨枝芳，周小表，卿尚喜

（1邵阳市中心医院耳鼻喉科 湖南 邵阳 422000）

（2邵阳市中心医院病理科 湖南 邵阳 422000）

（3邵阳市中心医院检验科 湖南 邵阳 422000）

慢性鼻窦炎（CRS）是一种常见病、多发病，发病机制复杂，病因未明。特别是慢性嗜酸细胞性鼻窦炎（ECRS），主要由嗜酸性粒细胞（Eos）浸润，术后炎症难以控制，复发率高。慢性鼻窦炎分为两种亚型，伴有或不伴有鼻息肉。该分类没有体现表型（炎症特征）和发展趋势（是否易复发），难以实施针对性的治疗。嗜酸性粒细胞（Eos）在鼻黏膜组织中大量聚集，表明其在发病机制中起重要作用[1]。TMT定量蛋白质组结合液相质谱法，选出差异蛋白，分析其作用与功能，为阐明ECRS的发病机制，寻找治疗靶点提供依据。

1.资料与方法

1.1 一般资料

标本采集自邵阳中心医院耳鼻喉科2018年10月—2019年7月收治的12例患者，男6例，女6例。ECRS组4例，非ECRS组4例，正常对照组4例（仅鼻中隔偏曲）。所有患者均无哮喘史或阿司匹林过敏史，术前2周未使用抗生素或激素。所有患者均签署知情同意书。平均年龄为（46.7±1.54）岁。鼻黏膜和鼻息肉标本在鼻内镜下采集固定，在病理科进行标本的组织学形态和Eos的显微镜下观察。另一部分标本用生理盐水快速冲洗，去除血和骨碎片。PBS冲洗后，用锡箔纸包好，放入塑料冷藏管中，-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1主要试剂和仪器 蛋白定量试剂盒、TMT试剂购于Thermo Fisher Scientific公司，十二烷基磺酸钠购于Amresco公司，乙腈购于J.T.Baker公司，胰酶购于Gibco公司。其余试剂为国产分析纯级别。

1.2.2提取标本裂解和蛋白定量 样品裂解及蛋白定量：解冻后，用预冷PBS洗涤3次，加入适量的裂解液，电动研磨装置充分匀浆。组织裂解液95 ℃孵育至完全变性。室温离心，取上清液置于全新的微离心管中。荧光光谱法测定氨基酸序列中的色氨酸。光度计检测色氨酸荧光强度。用色氨酸标准曲线计算样品中色氨酸的浓度，得到样品中蛋白质的浓度。采用样品选择、蛋白质提取和定量步骤控制实验质量。蛋白质酶解：取样品加入超滤管中。离心后，弃滤液。加入缓冲液，离心，弃滤液。加入吲哚乙酸，室温反应，离心后弃滤液。加入碳酸三乙二胺缓冲液，离心后弃滤液。加入胰酶质谱测序，37℃消化过夜。收集滤液，冷冻干燥。100 mmol/L三乙胺硼烷溶解样品，检测pH约8.5。TMT标记试剂加入各组肽段中，混匀，摇床室温4h。加入羟胺终止反应，摇床室温20min。等比混合，酸化样品，脱盐、抽干。

1.2.3 液相色谱质谱联用分析以及数据检索

抽干后样品用2%甲酸溶解；12 000 r/min离心5 min，进行LC-MS/MS（液相色谱质谱联用）分析。HPLC反向柱层析系统采用300 nl/min流速，乙腈梯度进行样品分离检测，时间4 h；HPLC与LTQ Orbitrap XL质谱偶联，从一级谱图中选取信号最强的3个进行HCD碎裂。数据使用Proteome Discoverer软件分析。

1.2.4生物信息学分析

选择表达变化大于1.3倍（蛋白比大于1.3或小于0.75）的蛋白作为差异蛋白。对这些蛋白进行基因本体（GO）注释分析和功能聚类分析。从数据库中检索差异蛋白，并对其功能进行分类分析。

1.3统计方法

统计处理：采用IBM SPSS Statistics 20.0统计软件。根据不同TMT试剂报告的离子相对丰度，得到蛋白质的相对定量结果。同一蛋白在一组与另一组之间的比值（Ratio）认为大于1.3倍，即大于1.3表示上调，小于0.75表示下调，认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 苏木精-伊红染色区分组织学类型

随机选择5个高倍显微镜视野（×400）进行计数，计算Eos在炎症细胞总数中的平均百分比，达到10%为ECRS，其余为非ECRS[2]。ECRS上皮下基质中嗜酸性细胞浸润较多，非ECRS间质中偶见嗜酸性细胞浸润。见图1。

图1 ECRS组织病理学形态

2.2 组织差异蛋白质的质谱鉴定与初步分析

嗜酸性阳离子蛋白、IL-33因子、垂体腺苷酸环化酶激活肽、IL-31因子、核苷二磷酸激酶、PLUNC蛋白在ECRS组织中表达较正常对照组鼻黏膜组织呈显著性差异。见表1所示。

表1 ECRS与非ECRS组织中部分差异表达蛋白

3.讨论

嗜酸性阳离子蛋白（ECP）主要来源于活化的Eos脱颗粒，具有多种生物活性，主要分为细胞毒性和非细胞毒性效应，强大的细胞毒性效应可引起寄生虫杀灭、肿瘤细胞杀死、呼吸道损伤。Eos脱颗粒释放ECP等毒性蛋白在发病机制中至关重要。IL-5和Eos趋化素Eotaxin等在聚集活化Eos过程中被证实必不可少。Bacher等发现IL-5在绝大多数鼻息肉标本大量表达，而在对照组却没有，说明主要由Eos产生的IL-5在Eos主导的鼻息肉发病机制中起关键作用，且可能存在一个自分泌环。Kramer等[3]更进一步指出IL-5在嗜酸性炎症组织中处于枢纽地位。Reh等应用CpG刺激难治性CRSwNP粘膜上皮细胞24 h，发现IL-33表达明显上调，提示IL-33表达可能在外界刺激下发生改变。有报告发现在筛窦炎症黏膜中IL-31、IL-33及其受体ST2，和对照组相比，明显高表达[4]。本研究中，与对照组正常黏膜相比，IL-33在ECRS组和非ECR组的蛋白表达水平明显上调。ECRS免疫学特性是引起强烈Th2反应，病理特点是Eos渗透，猜测IL-33可能在介导Eos优势渗透中起监管及调节作用。垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）是由抗原或炎症刺激淋巴细胞产生的神经肽。研究表明，PACAP抑制促炎反应因子，促进抗炎因子IL-10的产生，调节Th1细胞向Th2细胞的分化。有望用于治疗急慢性炎症、感染性休克或自身免疫性疾病。本研究发现，它们在ECRS中表达量较高，推测细菌、病毒、真菌等病原体激活了鼻粘膜炎症防御反应系统。核苷二磷酸激酶可以催化磷酸化反应，在炎症性疾病中的作用还有待进一步研究。PLUNC蛋白质是一种上呼吸道分泌蛋白，表达于上呼吸道和口腔。它属于脂多糖结合蛋白和/或抗革兰氏阴性菌入侵的增透蛋白，可能在上呼吸道先天免疫应答中发挥作用。

总之，ECRS发病机制复杂，是多种因素共同作用的结果，难点在于病因的研究和可能的根治性治疗[5]。TMT定量蛋白质组学能有效筛选ECRS组织中的差异蛋白。嗜酸性阳离子蛋白、IL-33因子、PACAP、IL-5因子、核苷二磷酸激酶、PLUNC蛋白，与ECRS的发生发展相关，可作为ECRS的候选标志物。哪一种或几种蛋白质起作用还待进一步研究。